This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.
Один из самых стимулирующих наблюдений в эволюции растений корреляция между возникновением геомагнитного поля (ГМП) развороты (или экскурсии) и момент излучения покрытосеменных. Это привело к предположению, что изменения в GMF полярности может играть роль в эволюции растений. Здесь мы опишем метод, чтобы проверить эту гипотезу, подвергая Arabidopsis THALIANA искусственно обратную условия ГМП. Мы использовали три оси магнитометр и собранные данные были использованы для расчета величины ГМП. Три источника питания постоянного тока были связаны с тремя парами катушек Гельмгольца и контролировались с помощью компьютера, чтобы изменить условия ГМП. Растения, выращенные в чашках Петри были подвержены как прямой и обратной условия ГМП. Также были выполнены с имитацией экспериментов по воздействию. Открытые растения были сфотографированы во время эксперимента и изображения были проанализированы, чтобы рассчитать длину корней и листьев области. Arabidopsis Суммарную РНК экстрагировали и количественныйВ режиме реального времени-ПЦР (КПЦР) проводились анализы экспрессии генов круциферина 3 (CRU3), медь транспортной protein1 (COTP1), окислительно-восстановительного потенциала Отзывчивый Транскрипция Factor1 (RRTF1), Fe супероксиддисмутазы 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal аскорбатпероксидазы (TAPX), цитозольным Аскорбат Peroxidase1 (APX1), и НАДФН / респираторный взрыв оксидазы белок D (RbohD). Четыре различных опорных генов были проанализированы, чтобы нормализовать результаты количественной ПЦР. Лучший из четырех генов была выбрана и был использован наиболее стабильный ген нормализации. Наши данные показывают, впервые, что изменение полярности ГМП использованием трехосных катушек оказывает значительное влияние на рост растений и экспрессии генов. Это подтверждает гипотезу о том, ГМП разворота способствует индукции изменения в развитии растений, которые могли бы оправдать более высокую селективное давление, в конечном итоге приводит к рLant эволюция.
Магнитное поле Земли (или, что эквивалентно геомагнитное поле, ГМП) является неизбежным фактором окружающей среды для всех организмов, живущих на планете, в том числе растений. ГМП всегда была естественной чертой Земли, так в процессе эволюции, все живые организмы испытали его действие. Растет количество доказательств показывает, что ГМП имеет возможность влиять на многих биологических процессах 1. ГМП не является равномерным, и существуют значительные различия в местных его величине и направлению на поверхности Земли. ГМП на поверхности Земли показывает широкий спектр величин, начиная с менее чем 30 мкТл почти 70 мкТл. ГМП защищает Землю и ее биосферу от смертельных последствий солнечного ветра, отклоняя большинство его заряженных частиц через магнитосферу 2.
Растения реагируют на стимулы окружающей среды; и классические ответы на абиотических факторов, таких как свет и тяжести были тhoroughly описывается определение так называемых фототропным и ГРАВИТРОПИЧЕСКУЮ ответов. Очень мало, или ничего, как известно, на механизмы восприятия и реакций растений к воздействию магнитных полей, несмотря на множество работ, опубликованных по этой теме, а недавно рассмотренных 1. В отличие от гравитационного поля, ГМП изменилось последовательно в ходе эволюции растений, таким образом, представляет собой важный фактор абиотической стресс, который недавно был рассматриваться в качестве потенциального движущей силой в конечном итоге способствует диверсификации и посадить видообразование 2. Геомагнитных инверсий (или экскурсии) изменения в полярности ГМП. Во время жизни земной истории, инверсии ГМП произошло несколько раз. Они подвергаются планеты периодов пониженной прочности GMF во время каждого перехода полярности. Некоторые авторы предположили, что эти переходы периоды низкой прочностью GMF может позволили ионизирующего излучения от солнечного ветра, чтобы достичь поверхности Земли, тем самым индуцируясоответствует стресс для живых организмов, которые могли бы быть достаточно сильным, чтобы вызвать генные изменения в конечном итоге приводит к эволюции растений 2.
Детальный анализ экспериментов, описывающих эффекты магнитных полей на растения показывает большое количество противоречивых сообщений, характеризующихся нехваткой вероятных механизмов взаимодействия биофизических. Многие эксперименты просто нереально, а другие не имеют проверяемые гипотезы и, в конечном счете, являются неубедительными 3. За последние годы, прогресс и состояние исследований по влиянию магнитных полей на заводе был рассмотрен 2,4-11. Недавно, эффект низких и высоких магнитного поля была подробно рассмотрена 1, с особым акцентом на участии разворота событий ГМП на эволюции растений 2.
Наиболее прямым способом обосновать гипотезу, что инверсии ГМП влияет эволюция завод синтезировать ГМПразворот в лаборатории тестированием ответа растений к прямой и обратной магнитных полевых условиях. Чтобы проверить гипотезу, поэтому мы построили трехосный восьмиугольную Кольца Гельмгольца-пар магнитное поле компенсационной системы (трехосные катушки), которая в состоянии точно вспять нормальные условия ГМП.
Мы использовали Arabidopsis THALIANA в качестве модели завода, и мы протестировали эффект обратной ГМП на экспрессию генов некоторых важных генов: круциферина 3 (CRU3), который кодирует хранения белка 12S семян, тирозин-фосфорилированный и его фосфорилирование состояние модулированный в ответ АБА в семенах Arabidopsis THALIANA 12,13; Медный Транспорт Protein1 (COTP1), который кодирует тяжелых металлов транспорт / детоксикации сверхсемейства белок с преобладающей функцией в почве приобретения Cu и развития пыльцы 14; и окислительно-восстановительного потенциала Отзывчивый Транскрипция Factor1 (RRTF1),который кодирует член ERF (коэффициент отклика этилена) подсемейства B-3 ERF / AP2 фактора транскрипции семейства, который содержит один домен AP2, что облегчит синергетический сотрудничество активации генов путей выражения и присваивать кросс толерантность к абиотическим и биотическим стрессам 15.
Кроме того, мы также проанализировали пять генов, участвующих в окислительных реакции на стресс: Fe супероксид Dismutase1, (FSD1), который кодирует цитоплазматический фермент, который ферментативно и быстро преобразует супероксид-анион (O2 -) и воды (H 2 O) с перекисью водорода (Н 2 О 2) и молекулярный кислород (O 2), 16; Catalase3 (CAT3), что, что кодирует и фермент, который катализирует распад H 2 O 2 в воде кислорода и 17,18; Thylakoidal аскорбатпероксидазы (TAPX), который кодирует хлорпластического тилакоидной пероксидазы, что очищает H 2 O2 19; Аскорбат Peroxidase1 (APX1), который кодирует пероксидазу цитозольную, что очищает H 2 O 2 и является одним из потенциальных мишеней пост-трансляционных модификаций, опосредованных NO-производных молекул 20; и NADPH- респираторный взрыв оксидазы белок D (RbohD), который кодирует фермент, который генерирует O 2 – и играет центральную роль в регулировании роста, развития и ответные реакции на стресс Arabidopsis 21.
Наша методология поля разворота обеспечивает первое свидетельство, что ГМП разворот может вызвать значительные изменения в морфологии и генной экспрессии А. THALIANA корни и побеги. Этот протокол обеспечивает инновационный способ оценки влияния ГМП разворота на морфологию растений и экспрессии генов и могут быть использованы для оценки потенциального влияния ГМП разворота по другим аспектам поведения растений и тем самым вести обсуждение роле ГМП разворота на эволюции растений.
Мы недавно показали, что удивительная корреляция между ГМП и время, когда отвлечение большинство семейных покрытосеменных линий произошло 2. Тем не менее, несмотря на стимулирующие гипотез и множество исследований о влиянии разнообразных интенсивности ГМП, в предположении, что ГМП разворот может сам вызывают значительные изменения в экспрессии генов растений и морфологии никогда не была продемонстрирована. Здесь показано впервые, метод, который использует трехосный восьмиугольную Гельмгольца катушку обратной ГМП в нашей лаборатории, и что поворот окружающего магнитного поля может привести к фенотипические изменения и модуляции экспрессии гена в растениях.
Для того чтобы получить GMF разворот (или изменения) в течение достаточного объема для экспериментов по выращиванию растений (2 х 2 х 2 м 3), мы создали систему восьмиугольную катушки Гельмгольца. Эта система не является коммерчески доступных (как правило, катушки Гельмгольца которые кольцеобразный и меньше)и затраты на строительство были значительными. Важно отметить, что эта система обеспечивает надежную модификацию поля, с исключительным времени стабильность и однородность в модифицированных магнитных полей.
Система спроектирована и построена, чтобы уменьшить значение ГМП до тысячной доли нормальных условиях или отменить любой из трех размеров магнитного поля. Однако конструкция из катушек не позволяет генерировать высокую напряженность магнитного поля. Таким образом, этот инструмент в настоящем виде не подходит для экспериментов, чтобы оценить эффект высокого магнитного поля на растения или других организмов.
В лаборатории, изменение ГМП, аналогичных описанным в данном методе было получено различными методами, в том числе защиты от окружающих экспериментальную зону ферромагнитными металлических пластин с высокой магнитной проницаемостью, которые отклоняются магнитных полей и концентрируют их в самом металле. Чте Преимущество использования катушки Гельмгольца, что система позволяет растениям быть подвержены более естественных условиях (света, циркуляции воздуха, и т.д.), что делает его идеально подходит не только для исследований в пробирке (как с использованием чашек Петри), но также для в естественных условиях роста растений и экспериментов в области развития. Размеры нашей системе создать пространство, которое позволяет подавление до <1/1000-природного ГМП в течение 25 х 25 х 25 см 3 сферического объема (рис 1А), что позволяет провести несколько пластин Петри или небольшие горшки для роста растений.
Метод, представленный здесь, был применен к биологии растений исследований; Однако, система позволяет широкий спектр экспериментов, в том числе вирусологии и микробиологии, а также исследования по нематод (например, Caenorhabditis Элеганс), членистоногих и мелких животных (в том числе мышей и крыс). Таким образом, испытания гипотезы, что инверсия ГМП способенчтобы вызвать морфологические и транскрипционные изменения также может быть распространено на многих других живых систем, возможно, в конечном счете, даже человеческих клеток.
ГМП постоянно меняется и колеблется. Таким образом, в наших экспериментах одним из основных задач является обеспечение постоянной компенсацию ГМП для того, чтобы получить желаемые новые значения ГМП. Это может быть достигнуто только путем непрерывного контроля магнитных полей значений посредством чтения значений магнитометра и компенсации напряжения. Таким образом, система может компенсировать медленно меняющуюся часть ГМП, но он ничего не делает для высших частоты колебаний.
В заключение, использование трехосных катушек переломить вектор GMF способствовал, чтобы продемонстрировать, что этот поворот вектора ГМП способен индуцировать морфологические изменения растений и дифференциальным выражением генов. Результаты, полученные с предложенного метода обеспечивают убедительные доказательства в пользу гипотезы, что ГМП повторногоversals, возможно, было одной из движущих сил для эволюции растений в течение геологических масштабах времени 2.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).
three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Ethanol | Sigma | 2860 | |
GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
Petri dish square (120×120) | Sigma | Z692344 |