This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.
واحدة من الملاحظات الأكثر محفزة في تطور النبات هو وجود علاقة بين حدوث المجال المغنطيسي الأرضي (GMF) انتكاسات (أو الرحلات) ولحظة الإشعاع من كاسيات البذور. وأدى ذلك إلى الفرضية القائلة بأن التغيرات في GMF القطبية قد تلعب دورا في تطور النبات. هنا، نحن تصف طريقة لاختبار هذه الفرضية من خلال تعريض thaliana نبات الأرابيدوبسيس لعكس مصطنع الظروف GMF. استخدمنا المغنطيسية ثلاثة محاور واستخدمت البيانات التي تم جمعها لحساب حجم GMF. تم ربط ثلاثة إمدادات الطاقة DC إلى ثلاثة أزواج هيلمهولتز لفائف وكان يسيطر عليها جهاز كمبيوتر لتغيير الظروف GMF. تعرض النباتات التي تزرع في لوحات بيتري إلى العادية وعكس الظروف GMF. وأجريت أيضا تجارب التعرض الشام. تم تصوير النباتات المعرضة أثناء التجربة، وتم تحليل الصور لحساب طول الجذر والمناطق ورقة. تم استخراج نبات الأرابيدوبسيس مجموع RNA والكميأجريت الوقت-PCR الحقيقي (QPCR) التحليلات على التعبير الجيني من CRUCIFERIN 3 (CRU3)، protein1 النقل النحاس (COTP1)، الأكسدة والاختزال مجيب النسخ Factor1 (RRTF1)، الحديد فوق الأكسيد الأكسيد 1، (FSD1)، Catalase3 (CAT3)، Thylakoidal أسكوربات البيروكسيد (TAPX)، وأسكوربات عصاري خلوي Peroxidase1 (APX1)، وNADPH / التنفسي البروتين انفجار أوكسيديز D (RbohD). وقد تم تحليل أربع جينات مرجعية مختلفة لتطبيع نتائج QPCR. وقد تم اختيار أفضل الجينات الأربعة، وكان يستخدم في الجينات الأكثر استقرارا للتطبيع. وتشير البيانات المتوفرة لدينا لأول مرة أن عكس القطبية GMF باستخدام لفائف triaxial له تأثيرات كبيرة على نمو النبات والتعبير الجيني. وهذا يدعم فرضية أن يساهم GMF انعكاس لإحداث تغييرات في التنمية النباتية التي قد تبرر الضغط العالي انتقائية، مما يؤدي في النهاية إلى pتطور LANT.
المجال المغناطيسي للأرض (أو مكافئ المجال المغنطيسي الأرضي، GMF) هو العامل البيئي لا مفر منه لجميع الكائنات الحية على كوكب الأرض، بما في ذلك النباتات. كانت GMF دائما سمة طبيعية من الأرض، وذلك أثناء التطور، شهدت جميع الكائنات الحية عملها. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تظهر أن GMF غير قادرة على التأثير على العديد من العمليات البيولوجية 1. وGMF ليست موحدة وهناك اختلافات محلية كبيرة في حجمها واتجاهها على سطح الأرض. وGMF على سطح الأرض يظهر مجموعة واسعة من المقادير، تتراوح بين أقل من 30 μT إلى ما يقرب من 70 μT. وGMF يحمي الأرض والمحيط الحيوي لها من آثار قاتلة من الرياح الشمسية من خلال تشتيت معظم جسيمات مشحونة من خلال المغنطيسي 2.
النباتات تستجيب للمؤثرات البيئية؛ والاستجابات الكلاسيكية إلى العوامل البيئية، مثل الضوء والجاذبية كانت روصف horoughly عن طريق تحديد ما يسمى الردود موجه ضوئيا وgravitropic. القليل جدا، أو لا شيء، كما هو معروف على آليات الإدراك وردود محطات للمجالات المغناطيسية، على الرغم من كثرة الأبحاث المنشورة حول هذا الموضوع، ومؤخرا استعرض 1. وخلافا للمجال الجاذبية، غيرت GMF باستمرار خلال تطور النبات مما يمثل عامل ضغط أحيائية الهامة التي تم النظر فيها مؤخرا قوة دافعة المحتملة في نهاية المطاف المساهمة في زرع التنويع وأنواع جديدة 2. انتكاسات المغناطيسية الأرضية (أو الرحلات) هي التغيرات في قطبية GMF. خلال تاريخ الحياة على الأرض، وقعت انتكاسات GMF عدة مرات. هذه يتعرض كوكب الأرض لفترات اضمحلال قوة GMF خلال كل الانتقال القطبية. وقد افترض بعض الكتاب أن هذه التحولات فترات انخفاض قوة GMF قد سمحت الإشعاع المؤين من الرياح الشمسية للوصول إلى سطح الأرض، وبالتالي حفزالإجهاد ثابت للكائنات الحية، التي كان يمكن أن تكون قوية بما يكفي لإحداث تغيرات الجينات مما يؤدي في النهاية إلى زرع تطور 2.
ويظهر تحليل مفصل للتجارب تصف آثار الحقول المغناطيسية على النباتات عددا كبيرا من التقارير المتضاربة، التي تتميز قلة آليات التفاعل الفيزيائية الحيوية المعقولة. العديد من التجارب هي ببساطة غير واقعية، فيما يفتقر آخرون فرضية قابلة للاختبار، وفي نهاية المطاف، غير مقنعة 3. على مدى السنوات الماضية، وقد استعرضت التقدم ومركز الأبحاث على تأثير المجالات المغناطيسية على محطة 2،4-11. في الآونة الأخيرة، وتأثير كل من المجال المغناطيسي المنخفضة والعالية قد نوقشت باستفاضة 1، مع التركيز بشكل خاص على إشراك الأحداث انعكاس GMF على تطور النبات 2.
أكثر الوسائل المباشرة لإثبات فرضية أن الانتكاسات GMF تؤثر على تطور المصنع هو لتجميع GMFانعكاس في المختبر عن طريق اختبار استجابة النباتات للظروف الحقل المغناطيسي طبيعية وعكسه. لاختبار هذه الفرضية، وبالتالي فإننا بنينا مثمنة هيلمهولتز لفائف أزواج المجال المغناطيسي نظام التعويض triaxial (لفائف triaxial)، التي هي قادرة على عكس بدقة الظروف GMF العادية.
كنا نبات الأرابيدوبسيس thaliana كما مصنع نموذج ونحن اختبار تأثير عكس GMF على التعبير الجيني لبعض الجينات الهامة: CRUCIFERIN 3 (CRU3)، الذي يشفر بروتين تخزين 12S البذور التي هي التيروزين مفسفر والتضمين الدولة الفسفرة في الرد لABA في بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana 12،13. النقل Protein1 النحاس (COTP1)، الذي يشفر بروتين الفصيلة نقل المعادن الثقيلة / إزالة السموم مع وظيفة السائدة في التربة اقتناء النحاس والتنمية حبوب اللقاح 14؛ والأكسدة والاختزال مجيب النسخ Factor1 (RRTF1)،الذي يشفر عضوا في ERF (عامل استجابة الإثيلين) فصيلة B-3 من ERF / AP2 عامل النسخ الأسرة الذي يحتوي على نطاق AP2 التي تسهل التآزر شارك في تفعيل الجينات مسارات التعبير ومنح التسامح عبر لالحيوي وغير الحيوي يؤكد 15.
وعلاوة على ذلك نحن أيضا بتحليل خمس جينات لها دور في استجابات التوتر التأكسدي: الحديد فوق الأكسيد Dismutase1، (FSD1)، الذي يشفر انزيم حشوية أن إنزيمي وبسرعة تحويل أنيون الفائق (O 2 -) والماء (H 2 O) لبيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2) والأكسجين الجزيئي (O 2) 16؛ Catalase3 (CAT3)، أن الذي يشفر والإنزيم الذي يحفز انهيار H 2 O 2 في الماء والأكسجين 17،18؛ Thylakoidal أسكوربات البيروكسيد (TAPX)، الذي يشفر الغلوثانيون الثايلاكويد البلاستيدات الخضراء التي يقتات H 2 O2 19، أسكوربات Peroxidase1 (APX1)، الذي يشفر الغلوثانيون عصاري خلوي أن يقتات H 2 O 2 وتمثل أحد الأهداف المحتملة لمرحلة ما بعد التعديلات متعدية بوساطة الجزيئات NO المشتقة 20؛ وNADPH- التنفسي البروتين انفجار أوكسيديز D (RbohD) الذي يشفر وهو الانزيم الذي يولد O 2 – ويلعب دورا محوريا في تنظيم النمو والتنمية واستجابات التوتر في نبات الأرابيدوبسيس 21.
توفر لدينا منهجية ميدانية عكس أول دليل على أن GMF انعكاس يمكن أن تحدث تغييرا كبيرا في التشكل والتعبير الجيني من A. الجذور والبراعم thaliana. يوفر هذا البروتوكول طريقة مبتكرة لتقييم تأثير GMF انعكاس على مورفولوجيا النبات والتعبير الجيني، ويمكن استخدامها لتقييم الأثر المحتمل للGMF انعكاس على جوانب أخرى من السلوك النبات، وبالتالي توجيه مناقشة ريال عمانيلو من GMF انعكاس على تطور النبات.
أظهرنا مؤخرا أن علاقة مذهلة موجود بين انتكاسات GMF والوقت عند تحويل معظم الأنساب كاسية البذور الأسرية حدث +2. ومع ذلك، على الرغم من الفرضيات محفزة وعدد كبير من الدراسات حول تأثير شدة GMF متنوعة، على افتراض أن GMF عكس نفسه قد تحدث تغييرات كبيرة في التعبير الجيني النباتي والتشكل لم يتم إثبات. نحن هنا تظهر لأول مرة، وهو أسلوب يستخدم triaxial مثمنة هيلمهولتز لفائف لعكس GMF في المختبر لدينا، وهذا عكس المجال المغناطيسي المحيط يمكن ان تسبب تغيرات المظهرية والتشكيل في التعبير الجيني في النباتات.
من أجل الحصول على GMF عكس (أو تعديل) على حجم كاف لتجارب نمو النبات (2 × 2 × 2 م 3)، قمنا ببناء نظام لفائف هيلمهولتز مثمنة. هذا النظام لا يتوفر تجاريا (لفائف هيلمهولتز عادة ما تتشكل حلقة وأصغر)وكانت تكاليف البناء كبيرة. الأهم من ذلك، هذا النظام يوفر تعديل الحقل القوي، مع استثنائي وقت الاستقرار والتجانس في المجالات المغناطيسية المعدلة.
تم تصميم نظام وبنيت لخفض قيمة GMF إلى آلاف من ظروف طبيعية أو لعكس أي من الأبعاد الثلاثة للمجال المغناطيسي. ومع ذلك، فإن تصميم ملفات لا يسمح لتوليد قوة عالية المجال المغناطيسي. لذلك، هذه الأداة في شكلها الحالي غير مناسب لاجراء تجارب تهدف إلى تقييم تأثير ارتفاع قوة المجال المغناطيسي على النباتات أو الكائنات الحية الأخرى.
في المختبر، وقد تم الحصول على تغيير في GMF مماثلة لتلك التي وصفها في هذه الطريقة عن طريق وسائل مختلفة، بما في ذلك التدريع التي تحيط منطقة تجريبية لوحات معدنية المغناطيسية مع النفاذية المغناطيسية العالية، والتي تنحرف المجالات المغناطيسية والتركيز عليها في المعدن نفسه. عشره ميزة استخدام لفائف هيلمهولتز هي أن النظام يسمح النباتات لأن تتعرض لمزيد من الظروف الطبيعية (ضوء، دوران الهواء، وغيرها)، وبالتالي مما يجعلها مثالية ليس فقط للدراسات في المختبر (كما هو الحال مع استخدام أطباق بتري) ولكن أيضا لفي الجسم الحي نمو النبات وتجارب التنمية. أبعاد نظامنا خلق مساحة تسمح لقمع تصل إلى <1/1000 من GMF الطبيعي طوال 25 × 25 × 25 سم 3 حجم كروية (انظر الشكل 1A)، مما يسمح لاستضافة العديد من لوحات بيتري أو بعض الصغيرة الأواني لنمو النبات.
الطريقة المعروضة هنا تم تطبيقها على دراسات بيولوجيا النبات. ومع ذلك، فإن النظام يسمح مجموعة واسعة من التجارب، بما في ذلك الفيروسات والأحياء الدقيقة، فضلا عن دراسات على الديدان الخيطية (على سبيل المثال، ايليجانس انواع معينة)، المفصليات و الحيوانات الصغيرة (بما في ذلك الفئران والجرذان). ولذلك، اختبارات الفرضية القائلة بأن عكس GMF قادرللحث ويمكن أيضا أن يتم تمديد تغيرات شكلية والنسخي إلى العديد من الأنظمة الحية الأخرى، وربما في نهاية المطاف حتى إلى الخلايا البشرية.
وGMF في تغير مستمر والمتقلبة. لذلك، في تجاربنا تحديا كبيرا واحد هو توفير التعويض المستمر للGMF من أجل الحصول على القيم GMF الجديدة المطلوبة. ويمكن تحقيق ذلك إلا من خلال المراقبة المستمرة للقيم الحقول المغناطيسية من خلال قراءة القيم المغنطيسية وتعويض الجهد. لذلك، يمكن للنظام تعويض جزء متفاوتة ببطء من GMF ولكنه لا يفعل شيئا لتقلبات التردد العالي.
في الختام، كان استخدام لفائف triaxial لعكس ناقلات GMF أساسيا لإثبات أن هذا انعكاس للناقلات GMF قادر على إحداث تغيرات شكلية النبات والتعبير الفرق الجيني. النتائج المتحصل عليها مع الطريقة المعروضة توفر أدلة دامغة لدعم الفرضية القائلة بأن إعادة GMFربما كان versals واحدة من القوى الدافعة لتطور النبات على امتداد فترات زمنية جيولوجية 2.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).
three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Ethanol | Sigma | 2860 | |
GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
Petri dish square (120×120) | Sigma | Z692344 |