This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.
Een van de meest stimulerende waarnemingen in plantaardige evolutie een correlatie bestaat tussen het optreden van aardmagnetische veld (GMF) omkeringen (of excursies) en het moment van de straling van Angiospermen. Dit leidde tot de hypothese dat veranderingen in GMF polariteit een rol Plantenevolutie kunnen spelen. Hier beschrijven we een methode om deze hypothese te testen door blootstelling van Arabidopsis thaliana kunstmatig omgekeerde GMF omstandigheden. We gebruikten een drie-assige magnetometer en de verzamelde gegevens werden gebruikt om de omvang van de GMF berekenen. Drie DC voedingen zijn aangesloten op drie paren Helmholtz spoel en onder controle van een computer om de GMF omstandigheden veranderen. Planten in Petri-platen werden blootgesteld aan normale en omgekeerde GMF omstandigheden. Sham blootstelling experimenten werden ook uitgevoerd. Blootgesteld planten werden gefotografeerd tijdens het experiment en de beelden werden geanalyseerd om wortel lengte en blad gebieden berekenen. Arabidopsis totale RNA werd geëxtraheerd en kwantitatieveReal Time-PCR (qPCR) analyses werden uitgevoerd op genexpressie van CRUCIFERIN 3 (CRU3), koper transport protein1 (COTP1), Redox Responsive transcriptie factor1 (RRTF1), Fe Superoxide Dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal Ascorbaat Peroxidase (TAPX), een cytosolisch ascorbaat Peroxidase1 (APX1) es NADPH / respiratoire burst oxidase eiwit D (RbohD). Vier verschillende referentie genen werden geanalyseerd om de resultaten van de qPCR normaliseren. De beste van de vier genen werd geselecteerd en de meest stabiele gen voor normalisatie werd gebruikt. Onze gegevens tonen voor de eerste keer dat het omkeren van de GMF polariteit met drieassige spoelen heeft significante effecten op de groei van planten en genexpressie. Dit ondersteunt de hypothese dat GMF omkering bijdraagt tot het induceren van veranderingen in plantenontwikkeling een hogere selectieve druk kunnen rechtvaardigen, uiteindelijk leidend tot plant evolutie.
Magnetisch veld van de aarde (of equivalent het aardmagnetisch veld, GMF) is een onontkoombare omgevingsfactor voor alle organismen die op de planeet, met inbegrip van planten. De GMF is altijd al een natuurlijke eigenschap van de aarde, dus gedurende de evolutie, alle levende organismen ervaren haar optreden. Een toenemende hoeveelheid bewijsmateriaal blijkt dat de GMF is in staat om veel biologische processen 1 beïnvloeden. Het GMF is niet uniform en er aanzienlijke lokale verschillen in de grootte en richting aan het oppervlak van de aarde. De GMF aan het aardoppervlak toont een groot aantal grootheden, van minder dan 30 pT tot bijna 70 pT. De GMF beschermt de aarde en de biosfeer van de dodelijke gevolgen van de zonnewind door het afbuigen van de meeste van zijn geladen deeltjes door de magnetosfeer 2.
Planten reageren op prikkels uit de omgeving; en klassieke reacties op abiotische factoren zoals licht en zwaartekracht zijn t geweesthoroughly beschreven door het definiëren van de zogenaamde phototropic en gravitropic reacties. Zeer weinig of niets bekend is over de mechanismen van de waarneming en reacties van planten aan magnetische velden, ondanks de overvloed aan artikelen gepubliceerd over dit onderwerp en onlangs beoordeeld 1. In tegenstelling tot het gravitatieveld, de GMF veranderde voortdurend tijdens fabriek evolutie daarbij een belangrijke abiotische stressfactor die is onlangs beschouwd als een potentiële drijvende kracht uiteindelijk bijdragen aan diversificatie en soortvorming 2 planten vertegenwoordigen. Geomagnetische omkeringen (of excursies) zijn veranderingen in de polariteit van de GMF. Tijdens het leven-geschiedenis van de aarde, GMF omkeringen opgetreden meerdere malen. Deze blootgesteld de planeet om periodes van verminderde GMF kracht bij elke polariteit overgang. Sommige auteurs hebben de hypothese dat deze overgangen bij slecht GMF sterkte zou hebben toegestaan ioniserende straling van de zon wind naar het aardoppervlak bereikt, waardoor een inducerendconsistente stress levende organismen die sterk genoeg is om gen uiteindelijk veranderingen induceren leidend tot ontwikkeling 2 planten kunnen zijn.
Een gedetailleerde analyse van experimenten beschrijven de effecten van magnetische velden op planten toont een groot aantal tegenstrijdige rapporten, gekenmerkt door een gebrek aan aannemelijke biofysische interactie mechanismen. Veel experimenten zijn gewoon niet realistisch, terwijl anderen gebrek aan een toetsbare hypothese, en uiteindelijk zijn niet overtuigend 3. In de afgelopen jaren is de voortgang en status van het onderzoek naar het effect van magnetische velden op planten werd beoordeeld 2,4-11. Onlangs is het effect van zowel lage als hoge magnetische veld is grondig besproken 1, met bijzondere aandacht voor de betrokkenheid van de GMF omkering gebeurtenissen op plantaardige evolutie 2.
De meest directe manier om de hypothese onderbouwen dat GMF omkeringen invloed fabriek evolutie is om een GMF synthetiserenomkering in het laboratorium door het testen van de respons van planten op normale en omgekeerde magnetisch veld condities. Om de hypothese te testen, dus bouwden we een drieassige achthoekige Helmholtz spoel-paren magnetisch veld compensatiesysteem (triaxiaal coils), die in staat is om nauwkeurig te keren de normale GMF omstandigheden.
We gebruikten Arabidopsis thaliana als modelplant en het effect van omgekeerde GMF op genexpressie van enkele belangrijke genen getest: CRUCIFERIN 3 (CRU3), dat een 12S zaadopslageiwit dat tyrosine-gefosforyleerd en fosforyleringstoestand gemoduleerd in reactie codeert ABA in Arabidopsis thaliana zaden 12,13; de Copper Transport Protein1 (COTP1), dat een zwaar metaal transport / ontgifting superfamilie eiwit met de overheersende functie in de bodem Cu acquisitie en pollen ontwikkeling 14 codeert; en Redox Responsive transcriptie factor1 (RRTF1),dat codeert voor een lid van het ERF (ethyleen responsfactor) subfamilie B-3 van ERF / AP2 transcriptiefactor familie die een AP2-domein dat de synergetische co-activatie van genexpressie pathways vergemakkelijken en verlenen kruis tolerantie voor abiotische en biotische benadrukt 15 bevat.
Bovendien hebben we ook geanalyseerd vijf genen betrokken bij oxidatieve stress responsen: Fe Superoxide Dismutase1, (FSD1), dat een cytoplasmatisch enzym dat enzymatisch en snel zet het superoxide anion codeert (O 2 -) en water (H2O) waterstofperoxide (H 2 O 2) en moleculaire zuurstof (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), dat codeert en enzymen die de afbraak van H 2 O 2 katalyseert in water en zuurstof 17,18; Thylakoidal ascorbaatperoxidase (TAPX), dat codeert voor chloroplastische thylakoid peroxidase dat scavenges H 2 O2 19; Ascorbaat Peroxidase1 (APX1), die een cytosolisch peroxidase dat scavenges H 2 O 2 en is een van de mogelijke doelwitten van posttranslationele modificaties gemedieerd door NO-afgeleide moleculen 20 codeert; en NADPH- Respiratory burst oxidase-eiwit D (RbohD) die een enzym dat codeert genereert O 2 – en speelt een centrale rol in het reguleren van groei, ontwikkeling en stress responsen in Arabidopsis 21.
Onze field-reversal methodologie biedt het eerste bewijs dat GMF omkering van een significante verandering in de morfologie en genexpressie van A. kan induceren thaliana wortels en scheuten. Dit protocol verschaft een innovatieve manier om het effect van GMF omkering op plantenmorfologie en genexpressie evalueren en kan worden gebruikt om het potentiële effect van GMF omkering andere aspecten van plantaardige rijgedrag en daardoor leiden bespreking van de role van GMF omkering op plantaardige evolutie.
We hebben onlangs bleek dat een verbazingwekkende correlatie bestaat tussen GMF omkeringen en het tijdstip waarop omleiding van de meeste van de familiale Angiosperm lijnen plaatsgevonden 2. Ondanks de stimulerende hypothesen en de overvloed van studies naar het effect van uiteenlopende intensiteiten GMF, de aanname dat GMF reversal kunnen zich aanzienlijke veranderingen in genexpressie in planten en morfologie te induceren is nooit aangetoond. Hier tonen wij voor het eerst een methode die een triaxiale achthoekige Helmholtz spoel gebruikt om GMF keren in ons laboratorium, en dat de omkering van de omgevingslucht magnetisch veld fenotypische veranderingen en modulatie van genexpressie in planten kan leiden.
Om GMF omkering (of modificatie) over een toereikend voor plantengroei experimenten (2 x 2 x 2 m 3) te verkrijgen, bouwden we een achthoekige Helmholtz spoelsysteem. Dit systeem is niet in de handel verkrijgbaar (meestal Helmholtz spoelen ringvormige en kleiner)en de kosten voor de bouw waren aanzienlijk. Belangrijker nog, dit systeem levert robuuste veld wijziging, met een uitzonderlijke tijd-stabiliteit en homogeniteit in de gemodificeerde magnetische velden.
Het systeem is ontworpen en gebouwd om de waarde van de GMF tot een duizendste van de normale of voor één van de drie dimensies van het magneetveld omgekeerd. Echter, het ontwerp van de spoelen niet mogelijk om een hoge magnetische veldsterkte opwekken. Daarom is dit instrument de huidige vorm is niet geschikt voor experimenten ontworpen om het effect van hoge magnetische veldsterkte op planten of andere organismen.
In het laboratorium, is verandering van de GMF vergelijkbaar met die beschreven in deze methode verkregen door verschillende methoden, zoals door afscherming rond de experimentele zone van ferromagnetische metalen platen met een hoge magnetische permeabiliteit, die een magnetisch veld afwijken concentreren deze binnen het metaal zelf. The voordeel van Helmholtz spoelen is dat het systeem waarmee planten worden blootgesteld aan meer natuurlijke omstandigheden (licht, luchtcirculatie, etc.), waardoor het niet alleen ideaal in vitro studies (zoals bij gebruik van petrischalen), maar ook in vivo plantengroei en ontwikkeling experimenten. De afmetingen van ons systeem te creëren een ruimte die een onderdrukking tot <1/1000 van de natuurlijke GMF maakt gedurende een 25 x 25 x 25 cm 3 bolvormige volume (zie figuur 1A), waardoor een aantal Petri platen of enkele kleine hosten potten voor plantengroei.
De hier gepresenteerde methode is toegepast op planten biologisch onderzoek; echter, het systeem kan een groot aantal experimenten, waaronder virologie en microbiologie, alsmede studies over nematoden (bijvoorbeeld Caenorhabditis elegans), geleedpotigen en kleine dieren (zoals muizen en ratten). Daarom is het testen van de hypothese dat de omkering van de GMF staatinduceren morfologische en transcriptionele veranderingen kunnen ook worden uitgebreid tot veel andere levende systemen, misschien uiteindelijk zelfs menselijke cellen.
De GMF verandert voortdurend en schommelt. Daarom, in onze experimenten een grote uitdaging om een constante beloning van de GMF verstrekken om de gewenste nieuwe GMF waarden te verkrijgen. Dit kan alleen worden bereikt door een continue controle van magnetische velden waarden door het lezen van magnetometer waarden spanningscompensatie. Daarom kan het systeem de langzaam variërende gedeelte van de GMF compenseren maar het doet niets voor hogere frequentie fluctuaties.
Concluderend, het gebruik van triaxiale spoelen de GMF vector keren was instrumenteel aantonen dat deze omkering van de GMF vector kan planten morfologische veranderingen en differentiële genexpressie induceren. De verkregen met de gepresenteerde methode resultaten geven een overtuigend bewijs ter ondersteuning van de hypothese dat de GMF reversals zou kunnen zijn een van de drijvende krachten voor de plantaardige evolutie geologische tijdschalen 2.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).
three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Ethanol | Sigma | 2860 | |
GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
Petri dish square (120×120) | Sigma | Z692344 |