地磁気（Gmfと）と植物の進化：Gmfと逆転の影響に関する調査を<em>シロイヌナズナ</em>開発と遺伝子発現

三軸コイルの1設定 メモ ：図1は、GMFを逆転するために使用される三軸コイルを示しています。 そのプローブ三軸コイルに挿入された3軸磁力計、オンにします。 コンピュータの電源をオンにし、データが3軸磁気センサから収集することを可能にする磁力計のソフトウェアを起動します。 GMFの大きさを計算するために、磁力によって報告された部品の値を使用してください。例えば、磁力計値で：BXは6.39μTを=で= 36.08μT、Bzが= 20.40は、以下の式を使用して、μT41.94の電界強度を計算するμT：B = B GMF + B の追加 、ここでB の追加 =（Bxを2 + 2 +のBz 2）1/2（ すなわち、この例では 41.9μT。） 3 couplに接続された各1：（0-8V / 5Aおよび0-20V / 2.5A、50Wのデュアルレンジ）3つのDC電源をオンにしますヘルムホルツコイルのESとGPIB接続（ 図1B）を介してコンピュータに接続されています。 電源のセ​​ット電圧が反転磁界ベクトルと所望の磁場を発生させます。例えば、ステップ1.3で、ここでは説明計装のコイルサイズであるB GMFと、V新しい結果Bを生成するために、X = 0.00 V、V yを= 30.52 V、VのZ = 0.00 Vに電圧を設定します= B GMF + B 三軸コイル =（6.38、-36.08、20.39）μTは。 すなわち、BのGMFと同じ大きさで新しいフィールドが、異なる方向を指しています。 1.3で説明した手順を使用して、磁力計ソフトウェアで新しいフィールドを確認してください。 通常の両方に植物をさらすと、セクション2で説明したようにペトリ皿を使用して、GMF条件を逆転させました。 等しいフィールドの大きさを維持することによって、偽曝露実験を行います| B GMF |そして、維持垂直GMFと同等のフィールドの構成要素が、フィールド反転状態に比べて三軸コイル内の等しい電流と磁場の水平成分の方向（ すなわち、「北、東または西」）を変更します。 1.5で説明したように、コイルの電圧を変更することによってこれを行います。 注：この偽の露出は、潜在的な微妙な加熱またはいずれかのコイル自体またはコイルを制御するために使用される電子機器からの振動の影響を除外。 人員実験の残りの部分を実行し、および/またはデータを解釈するから盲目にフィールド条件を適用することにより、二重盲検試験を実行します。 植物材料と植物生育の条件の作製 5％（w / v）の次亜塩素酸カルシウム溶液および0.02％（v / v）のトリトンX-で処理することによって滅菌1.5 mlのチューブ表面にその後シロイヌナズナ 、コロンビア生態型0（COL 0）の種、場所を使用連続振とうしながら25〜28℃で10〜12分間、80％エタノール（エタノール）、100。その後、100％エタノールで洗浄し、80％EtOHで二回洗浄し、最終的に滅菌蒸留水で洗い流してください。 追加することで、メディアを変更しムラシゲ・スクーグ22（MS）の1リットルを準備し、MSの2.297グラム（0.5×MS基礎塩混合物）、10gのスクロース、1 L、KOHでpH調整5.8から6.0への脱イオン水を上に。 20分、120℃のために寒天、オートクレーブの16グラムを追加します。 固化する前に、各（120×120ミリメートル2）正方形のペトリ皿に培地80ミリリットルを注ぎます。プレートに30無菌種をまく、その後、ワックス状フィルムでプレートを密封します。 発芽を増強し、同期させるために4℃で2日間暗闇に水平プレートを開花結実を促進する、その後、正常またはGMFを逆のいずれかにペトリ皿を公開します。 三軸コイル内部の3軸コイルの外側の両方の並行実験で垂直位置で22℃の気候制御された環境で種子を公開ナトリウム蒸気ランプを使用して、8時間の闇と16時間の光の光周期スケジュール、下の（220×10 -6のEメートル-2秒-1）。ランプの赤色成分を低減するためにスポットライトの青のゼラチンフィルムを使用してください。 通常の（コントロール）と逆転（治療）の両方GMF条件にRNA抽出前に10日間の植物を公開します。 露光後、ペトリ皿の写真を撮ります。 根長と葉面積を計算するためにImageJソフトウェアを使用してください。 簡単に言うと、その後、ペトリプレートの画像を開いて、正確にプレート側を横切る線を引くための「ストレート」ラインオプションを使用して、ペトリプレートの側面を測定します。 「分析」メニューの「設定スケール」を選択し、「既知の距離」ボックス（例えば、120ミリメートル）は、長さ（mm）の単位を挿入実際の距離を挿入します。最終的にはすべての測定の設定が利用できるようにする「グローバル」オプションをクリックします。 カンガルーのためにトン長、フリーハンドツールを使用して慎重にルートの形状に従ってください。 「分析」メニューの「測定」オプションを使用して長さを測定します。画像内のすべての根を測定し、さらに統計分析のために、ファイルを保存し続けます。 葉面積については、「イメージ」メニューから調整オプションし、「カラーしきい値」を使用します。個々の葉を選択し、「分析」メニューの「粒子を分析する」を選択します。統計分析のための個々の測定値を保存します。 3. シロイヌナズナ全RNA抽出、定量的リアルタイムPCR（定量PCR）反応条件とシロイヌナズナのためのプライマー別途30芽や根30を収集し、直ちに液体窒素中で凍結します。その後、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で粉砕します。 機械製造を使用して精製キットおよびRNaseフリーDNase処理キットを用いて全RNAを単離しますERの指示。 製造業者の指示に従ってRNAナノキットおよびキャピラリーゲル電気泳動を使用して、サンプルの質と量を確認してください。分光光度法でRNAの定量を確認してください。 製造業者の推奨に従って、第一鎖cDNAを得るために、cDNAを逆転写キットを用いて全RNAおよびランダムプライマーを2μgを使用してください。 内部の負荷標準としてROXとサイバーグリーンを用いたリアルタイムシステム上のすべての実験を行います。 2X SYBRグリーン定量PCRマスターミックス12.5μlの、cDNAの0.5μlの100 nMのプライマーからなる混合物を25μlで反応を実行します。 表1に列挙されたプライマーを使用してください。（ゲノムDNA汚染を監視するために逆転写することなく、全RNAを使用して）コントロール非RTコントロールと非テンプレートコントロール（水の代わりに、テンプレート）に含めます。 標準を使用して全てのプライマー対のためのプライマーの効率を計算します曲線法23。 CRU3、COTP1、RRTF1：以下のPCR条件を使用してください。 95℃で10分間、95℃、58℃で30秒間、および72℃で30秒で15秒を40サイクル; UBP6、eEF1Balpha2、ACT1、GAPC2、CAT3、TAPX、APX1、RbohD、FeSOD1 10分95℃で、95°C、57°Cで20秒間、および72℃で30秒で15秒の40サイクル。 各アニーリングおよび伸長段階の後、蛍光をお読みください。すべての実行のために、熱プロファイルで解離セグメントを含むことにより、55〜95℃の融解曲線分析を行います。解離プロファイル（温度の関数としての蛍光のプロット）を表示するには、[結果]タブを介してアクセス解離曲線画面を使用します。実験の解離セグメント間に収集されたデータセットが分析/セットアップ画面を使用して、分析のために選択されていることを確認します。 Lを決定します3つの技術反復24,25で分析三つの独立したRNA抽出物からのcDNAを用いて10倍希釈系列（1〜3〜10倍）を行うことにより、閾値サイクル値（Ct値）に鋳型濃度の範囲inear。 Ct値を得るために、リアルタイムPCR機器ソフトウェアですべての増幅プロットを分析します。キャリブレーションとしては、次の最高のハウスキーピング遺伝子のレベルと相対的RNAレベルを正常化：3.11.1）[結果]タブを介してプロット画面で増幅にアクセスし、データを分析選択/設定画面を使用して分析する必要のあるランプや高原を選択し、してから、コマンドパネルの蛍光メニューからDRN（ベースライン補正された正規化された蛍光）を選択します。サンプル値は、サンプリングされたウェルについてのCt値を表示するには、[結果]タブを介してスクリーンプレートにアクセスします。 四つの異なる参照遺伝子を使用して[例えば、 細胞質のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、（GAPC2）、ユビキチンspecifICプロテアーゼ6（UBP6）、Actin1（ACT1）と伸長因子1（b）のαサブユニット2（eEF1Balpha2）]は、リアルタイムPCRの結果を正規化します。解析ソフトウェア26を用いたトップランクの遺伝子を選択します。そして、標準化のために最も安定した遺伝子を使用しています。 簡単に言えば、遺伝子名およびサンプル名を含む最初の行を含む最初の列でExcelシート上の入力データを整理します。次に、メニューバーから解析ソフトウェアを選択します。入力データを選択するためのダイアログボックスを使用します。 次に、フィールドにサンプル名、遺伝子名と簡単な出力だけをチェックします。解析を実行するGoボタンをクリックします。最も安定に発現候補遺伝子として（最小安定性値を有する）トップランクの遺伝子を選択します。 芽と根の両方の差動倍数変化の発現を示すことにより、プロットデータ。 4.統計分析 ±標準誤差平均値などのデータを表現。共同の比較ntrolと分散分析（ANOVA）およびボンフェローニとダン・シダック調整確率検定（0.95パーセントの信頼）とTukeyのテストの分析を行うことで、治療群。