This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.
L'une des observations les plus stimulants dans l'évolution des plantes est une corrélation entre la survenue de champ géomagnétique (GMF) reprises (ou excursions) et le moment de la radiation des Angiospermes. Cela a conduit à l'hypothèse que les altérations de GMF polarité peuvent jouer un rôle dans l'évolution des plantes. Ici, nous décrivons une méthode pour tester cette hypothèse en exposant Arabidopsis thaliana à inverser artificiellement conditions FMV. Nous avons utilisé un magnétomètre à trois axes et les données recueillies ont servi à calculer l'ampleur de la GMF. Trois DC alimentations ont été connectées à trois paires de bobines de Helmholtz et ont été contrôlés par un ordinateur pour modifier les conditions du FMV. Les plantes cultivées dans des boîtes de Pétri ont été exposés à la fois normal et inversé conditions FMV. Expériences d'exposition Sham ont également été réalisées. Plantes exposées ont été photographiés pendant l'expérience et les images ont été analysés pour calculer la longueur des racines et des surfaces foliaires. Arabidopsis ARN total a été extrait et quantitativePCR en temps réel (qPCR) Les analyses ont été effectuées sur l'expression du gène de la cruciférine 3 (CRU3), le transport du cuivre protein1 (COTP1), Redox Responsive Facteur1 transcription (RRTF1), Fe superoxyde dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), thylacoïdales ascorbate peroxydase (tapX), un ascorbate cytosolique Peroxidase1 (APX1), et le NADPH / respiratoires protéines rafale oxydase D (RbohD). Quatre gènes de référence différents ont été analysés afin de normaliser les résultats de la PCR quantitative. La meilleure des quatre gènes a été sélectionné et le gène le plus stable pour la normalisation a été utilisé. Nos données montrent pour la première fois que inversant la polarité GMF utilisant des bobines triaxiales a des effets importants sur la croissance des plantes et de l'expression des gènes. Ce soutient l'hypothèse que GMF inversion contribue à induire des changements dans le développement des plantes qui pourraient justifier une pression plus élevée sélective, pour aboutir finalement à pévolution lant.
Le champ magnétique de la Terre (ou de manière équivalente le champ géomagnétique, GMF) est un facteur environnemental incontournable pour tous les organismes vivants sur la planète, y compris les plantes. La GMF a toujours été une caractéristique naturelle de la Terre, afin cours de l'évolution, tous les organismes vivants connu son action. Un nombre croissant de preuves montre que le GMF est capable d'influencer de nombreux processus biologiques 1. Le FMV est pas uniforme et il ya d'importantes différences locales dans son ampleur et la direction de la surface de la Terre. Le GMF à la surface de la Terre présente une large gamme de grandeurs, allant de moins de 30 uT à près de 70 uT. Le GMF protège la Terre et sa biosphère des effets létaux de vent solaire en déviant la plupart de ses particules chargées à travers la magnétosphère 2.
Les plantes répondent à des stimuli environnementaux; et les réponses classiques aux facteurs abiotiques tels que la lumière et la gravité ont été thoroughly décrit en définissant les réponses dites phototropes et gravitropique. Très peu, ou rien, qui est connu sur les mécanismes de perception et de réponses des plantes à des champs magnétiques, malgré la pléthore d'articles publiés sur ce sujet et a récemment examiné 1. Contrairement au champ gravitationnel, la GMF a changé régulièrement au cours de l'évolution des plantes représentant ainsi une importante abiotique facteur de stress qui a été récemment considéré comme une force motrice potentielle éventuellement contribuer à planter diversification et spéciation 2. Inversions géomagnétiques (ou excursions) sont changements de polarité de la GMF. Pendant la vie histoire de la Terre, des inversions FMV ont eu lieu à plusieurs reprises. Ces exposés de la planète à des périodes de force GMF réduite pendant chaque transition de polarité. Certains auteurs ont émis l'hypothèse que ces transitions périodes de faible intensité pourraient GMF ont permis rayonnements ionisants du vent solaire d'atteindre la surface de la Terre, induisant ainsi unele stress cohérente pour les organismes vivants, qui aurait pu être assez forte pour induire des altérations génétiques conduisant finalement à planter évolution 2.
Une analyse détaillée des expériences décrivant les effets des champs magnétiques sur les plantes montre un grand nombre de rapports contradictoires, caractérisé par un manque de mécanismes d'interaction biophysique plausible. De nombreuses expériences sont tout simplement irréaliste, tandis que d'autres manquent d'une hypothèse vérifiable et, finalement, ne sont pas convaincantes 3. Au cours des dernières années, l'état d'avancement de la recherche sur les effets des champs magnétiques sur végétales a été étudié 2,4-11. Récemment, l'effet de champ magnétique à la fois basse et haute a été discuté à fond 1, avec un accent particulier sur la participation des événements d'inversion du FMV sur l'évolution de l'usine 2.
Les moyens les plus directs pour justifier l'hypothèse que les inversions du FMV affectent l'évolution des plantes est de synthétiser un GMFinversion du laboratoire en testant la réponse des plantes à des conditions de champ magnétique normale et inversée. Pour tester cette hypothèse, nous avons construit donc une bobine Helmholtz octogonale paires champ magnétique système de compensation triaxial (bobines triaxiales), qui est en mesure d'inverser précision les conditions normales du FMV.
Nous avons utilisé Arabidopsis thaliana comme plante modèle et nous avons testé l'effet de inversée GMF sur l'expression génétique de certains gènes importants: cruciférine 3 (CRU3), qui code pour une protéine de stockage 12S de semence qui est la tyrosine phosphorylée et son état de phosphorylation est modulée en réponse ABA dans les graines d'Arabidopsis thaliana 12,13; Cuivre Transport protein1 (COTP1), qui code une protéine de la superfamille transport de métaux lourds / désintoxication avec la fonction prédominante dans le sol acquisition Cu et le développement du pollen 14; et Redox Facteur1 transcription sensible (de RRTF1),qui code pour un membre de l'ERF (éthylène facteur de réponse) sous-famille B-3 de ERF / AP2 famille des facteurs de transcription qui contient un domaine AP2 qui facilitent la co-activation synergique de gène des voies d'expression et leur confèrent une tolérance croisée à abiotiques et biotiques souligne 15.
Par ailleurs, nous avons également analysé cinq gènes impliqués dans les réponses au stress oxydatif: Fe superoxyde Dismutase1, (FSD1), qui code pour une enzyme cytoplasmique qui convertit par voie enzymatique et rapidement l'anion superoxyde (O 2 -) et d'eau (H 2 O) au peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2) et de l'oxygène moléculaire (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), qui code pour et qui enzyme qui catalyse la décomposition de H 2 O 2 en eau et oxygène 17,18; ascorbate peroxydase thylacoïdales (tapX), qui code pour un peroxydase thylakoïde chloroplastique qui balaye H 2 O2 19; ascorbate Peroxidase1 (APX1), qui code pour une peroxydase cytosolique qui balaye H 2 O 2 et représente l'une des cibles potentielles de modifications post-traductionnelles induites par des molécules dérivées NO 20; et NADPH respiratoire protéines rafale oxydase D (RbohD) qui code une enzyme qui génère O 2 – et joue un rôle essentiel dans la régulation de la croissance, le développement et la réponse au stress chez Arabidopsis 21.
Notre méthodologie champ inversion fournit la première preuve que le FMV inversion peut induire un changement significatif dans l'expression de la morphologie et le gène de A. racines et des pousses thaliana. Ce protocole fournit un moyen novateur pour évaluer l'effet de la GMF inversion sur la morphologie de la plante et l'expression des gènes et peut être utilisé pour évaluer l'effet potentiel de retournement GMF sur d'autres aspects du comportement de la plante, et ainsi guider la discussion de la role renversement de GMF sur l'évolution de la plante.
Nous avons récemment montré qu'une étonnante corrélation existe entre les inversions de FMV et le moment où le détournement de la plupart des lignées familiales Angiospermes survenu 2. Cependant, malgré les hypothèses stimulantes et la pléthore d'études sur l'effet des intensités variées FMV, l'hypothèse que le FMV inversion peut se induire des changements importants dans l'expression des gènes de la plante et de la morphologie n'a jamais été démontrée. Ici, nous montrons pour la première fois, un procédé qui utilise une bobine de Helmholtz octogonal triaxial pour inverser GMF dans notre laboratoire, et que l'inversion du champ magnétique ambiant peut provoquer des changements phénotypiques et modulation de l'expression génique dans les plantes.
Afin d'obtenir l'inversion GMF (ou modification) sur un volume suffisant pour les expériences de la croissance des plantes (2 x 2 x 2 m 3), nous avons construit un système octogonale de bobines de Helmholtz. Ce système ne sont pas disponibles dans le commerce (bobines de Helmholtz sont généralement en forme d'anneau et plus petit)et les coûts de construction ont été considérables. Surtout, ce système offre une modification du champ robuste, avec des temps exceptionnelle stabilité et l'homogénéité dans les champs magnétiques modifiés.
Le système est conçu et construit pour réduire la valeur de la GMF à un millième des conditions normales ou de renverser l'un des trois dimensions du champ magnétique. Cependant, la conception des bobines ne permet pas de générer une intensité de champ magnétique élevé. Par conséquent, cet instrument dans sa forme actuelle ne convient pas pour des expériences visant à évaluer l'effet de la force du champ magnétique élevé sur les plantes ou d'autres organismes.
En laboratoire, l'altération de la GMF similaires à ceux décrits dans ce procédé a été obtenu par différentes méthodes, y compris le blindage en entourant la zone expérimentale par des plaques métalliques ferromagnétiques à perméabilité magnétique élevée, qui diffèrent des champs magnétiques et les concentrer au sein du métal lui-même. The avantage d'utiliser des bobines de Helmholtz est que le système permet aux plantes d'être exposés à des conditions plus naturelles (lumière, circulation d'air, etc.), ce qui le rend idéal non seulement pour les études in vitro (comme avec l'utilisation de boîtes de Pétri) mais aussi pour vivo la croissance de la plante et des expériences de développement. Les dimensions de notre système de créer un espace qui permet une suppression à <1 / 1000e du GMF naturelle tout au long d'un 25 x 25 x 25 cm 3 volume sphérique (voir la figure 1A), permettant ainsi d'accueillir plusieurs boîtes de Pétri ou certains petits pots pour la croissance des plantes.
La méthode présentée ici a été appliquée à des études de biologie végétale; Cependant, le système permet un large éventail d'expérimentation, y compris la virologie et de microbiologie, ainsi que des études sur les nématodes (par exemple, Caenorhabditis elegans), les arthropodes et les petits animaux (y compris les souris et les rats). Par conséquent, les tests de l'hypothèse que l'inversion de la GMF est capablepour induire des changements morphologiques et de transcription pourraient également être étendus à de nombreux autres systèmes de vie, peut-être en fin de compte, même pour les cellules humaines.
Le FMV est en constante évolution et fluctuante. Par conséquent, dans nos expériences un défi majeur est de fournir une compensation constante de la GMF pour obtenir les nouvelles valeurs souhaitées FMV. Cela ne peut être réalisé par un contrôle continu des valeurs de champs magnétiques à travers la lecture des valeurs de magnétomètres et compensation de tension. Par conséquent, le système peut compenser la partie variant lentement de la GMF, mais il ne fait rien pour les plus élevés fluctuations de fréquence.
En conclusion, l'utilisation de bobines triaxial pour inverser le vecteur FMV a contribué à démontrer que ce renversement du vecteur GMF est capable d'induire des changements morphologiques végétales et l'expression différentielle des gènes. Les résultats obtenus avec la méthode présentée fournissent une preuve convaincante à l'appui de l'hypothèse que la re GMFlettrines pourraient avoir été l'une des forces motrices de l'évolution des plantes sur des périodes géologiques 2.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).
three-axis magnetometer | Bartington | Mag-03MC | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer power supply | Bartington | Mag-03PSU | triaxial fluxgate magnetometer |
Magnetometer software | Bartington | Mag03DAM | triaxial fluxgate magnetometer |
DC power supply | Agilent Technologies | E3642A | |
Calcium hypochlorite | Sigma | 211389 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Ethanol | Sigma | 2860 | |
GroLux Sodium vapor lamps | OSRAM Sylvania | 600W | |
RNeasy Plant RNA kit | Qiagen | 74903 | |
RNase-Free DNase | Qiagen | 79254 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938B | |
NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific | not available | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Mx3000P | Agilent Technologies | 401512 | |
2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix | Fermentas International, Inc | K0221 | |
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
Petri dish square (120×120) | Sigma | Z692344 |