Arası hücresel iletişim içinde ve hücre dışında çeşitli fizyolojik aktiviteleri kontrol edilmesi için çok önemlidir. Bu kağıt tek hücre salgılarının uzay-zamansal yapısını ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Bunu başarmak için, bir multidisipliner bir yaklaşım canlı hücre görüntüleme ile algılama etiket içermeyen nanoplasmonic entegre olan kullanılır.
Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.
Inter-hücresel iletişim içinde ve hücre dışında hem birçok fizyolojik faaliyetlerin düzenlenmesi için çok önemlidir. Proteinlerin ve veziküller çeşitli daha sonra, farklılaşma, yara iyileşmesi, bağışıklık tepkisi, göç ve proliferasyon gibi kompleks hücresel süreçleri tetikler salgılanabilir. Hücre içi sinyal yollarının 1-5 arızaları kanseri, ateroskleroz da dahil olmak üzere pek çok bozukluklarda implike edilmiştir ve diyabet, birkaç isim.
Optimum hücre salgılama tahlili mekansal ve zamansal olarak ilgili sinyalizasyon yolları bozmadan ilgi salgılanan proteini eşleme kapasitesine sahip olmalıdır. Bu şekilde, konsantrasyon profilinin ve alıcı hücrelerin tepki arasındaki nedensel ilişki anlaşılabilir. Ne yazık ki, en yaygın olarak kullanılan floresan bazlı tekniklerin birçoğu bu kriterlere uymayan. Floresan füzyon proteinleri w analiti etiketlemek için kullanılabilirhücreyi ithin ancak salgı yolu bozabilir veya salgılanan eğer, ölçmek zordur hücrenin dışında yaygın kızdırma sonuçları. Floresan immunosandwich bazlı deneyler, hücresel salgıları tespit etmek için en sık kullanılan teknikler, ancak, tipik olarak, tek tek hücrelerin izolasyonunu gerektirir. Buna ek olarak, algılama antikoru verme tipik olarak durur veya deney ve antikor etiket büyüklüğü sona 6-11, 150 kDa IgG, aşağı sinyalizasyon bir engeldir.
Bu bariyerlerin bir etiket içermeyen bir teknik, görüntü proteini salgıları ve mevcut etiket içermeyen teknolojiler arasından kullanılan plazmon rezonans (SPR) yüzey lokalize yüzey plasmon rezonans (LSPR) sensörler iyi adaylardır tercih edilir çünkü. 12-17 Bu sensörleri yaygın proteinler, eksozom ve diğer biyo-analit bağlama çalışmaları için kullanılmıştır. 18-24 LSPR, plasmonik nanostr halindeuctures cam kapak slipleri lithographically desenli ve standart geniş alan mikroskopisi konfigürasyonlar yoluyla da görülebilir ışık kullanılarak heyecan edilebilir. Nedeniyle nano ayak izi, cam taban çoğunluğu 25-28. Böyle canlı hücre mikroskopi ile entegrasyon için uygun parlak alan ve iyi bu sondalar yapma floresan mikroskobu gibi yaygın görüntüleme teknikleri kullanılabilir Biz gerçek zamanlı ölçüm göstermiştir sırasıyla 225 msn ve 10 um, mekansal ve zamansal çözünürlükte Fonksiyonlu altın plasmonik nano kullanarak hibridoma hücrelerinden antikor sekresyonların. Temel çip konfigürasyonu Şekil 1 'de gösterilmiştir. 28 mikroskop çıkışı, ışık yolu görüntü için kullanılan bir CCD kamera ve nano belirli bir dizinin fraksiyonel doluluk (Şekil 2 nicel olarak belirlenmesi için bir fiber-optik açıdan bağlanmış spektrometre arasında bölünür ).
ProtocAynı anda standart aydınlık alan mikroskobu kullanarak hücrelerin tepkisini izlerken bu yazıda sunulan ol tek hücre salgılarının gerçek zamanlı ölçümü için deneysel tasarım açıklanır. Multidisipliner yaklaşım hücre çizgilerinin nano üretim, analitlerin yüksek afıniteli bağlanma için nano-fonksiyonalizasyonu, hem de non-spesifik bağlanma en aza indirilmesi ve ticari bir Yüzey Plazmon Rezonansı kullanarak hız sabitleri karakterize (SPR) enstrüman için bir yüzey optimizasyonu, entegrasyonu içerir substrat ve görüntü ve spektral verilerin analizi üzerine. Biz cep salgıları ve alıcı hücrelerle onların nedensel ilişkilerin uzay-zamansal haritalama için elverişli teknoloji olmak için bu tekniği tahmin ediyoruz.
The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.
There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines.
The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.33 Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
25mm diameter glass coverslips | Bioscience Tools | CSHP-No1.5-25 | 170±5 µm is optimal |
Poly-methyl methacrylate | Microchem | PMMA 950 A4 | |
Ethyl lactate methyl metacrylate | Microchem | MMA EL6 | |
Electron beam evaporator | Temescal | FC-2000 | |
Electron beam lithography | Raith | Series 150 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 320110 | |
CR-7 chromium etchant | Cyantek | CR-7 | |
Scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 55 | |
Atomic force microscope | Veeco | Nanoscope III | |
Plasma ashing system | Technics | Series 85 RIE | |
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO) | Prochimia | TH 001-m8.n3-0.2 | |
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC) | Prochimia | TH 003m11n3-0.1 | |
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN) | Prochimia | TH 002-m11.n3-0.2 | |
Surface plasmon resonance system | Biorad | XPR36 | |
Bare gold chip | Biorad | GLC chip | Plasma ashed to remove the monolayer |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo | 22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo | 24510 | |
Pentylamine-Biotin | Thermo | 21345 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
Neutraavidin | Thermo | 31000 | |
Phosphate buffered saline | Thermo | 28374 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axio Observer | Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH |
CCD camera | Hamamatsu | Orca R2 | Thermoelectrically cooled (16 bit) |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65Pro | |
Spectrasuite | Ocean Optics | version1.4 | |
c-myc peptide HyNic Tag | Solulink | SP-E003 | |
monoclonal anti-c-myc antibody | Sigma-Aldrich | M4439 | |
Hybridoma cell line | ATCC | CRL-1729 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Serum free media RPMI 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
Rhodamine DHPE | Life Technologies | L-1392 |