간 셀룰러 통신은 내부와 세포 외부의 각종 생리 활성 조절에 중요하다. 이 논문은 단일 세포 분비물의 시공간적 특성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이를 달성하기 위해, 종합 접근법 생균 이미징 감지 라벨없는 nanoplasmonic을 통합하는 데 사용된다.
Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.
간 셀룰러 통신은 내부와 세포 내외 많은 생리 활성의 조절을 위해 매우 중요합니다. 단백질과 소포의 다양한 이후 이러한 분화, 상처 치유, 면역 반응, 마이그레이션 및 확산 등의 복잡한 세포 과정을 트리거 것을 분비 될 수있다. 간 세포 신호 전달 경로의 1-5 오작동 암, 동맥 경화 등 다양한 질환에 연루되어 , 당뇨병, 몇 가지 이름을 지정합니다.
최적의 세포 분비 분석은 공간적으로 시간적 관련 신호 전달 경로를 방해하지 않고 관심의 분비 단백질을 매핑 할 수 있어야한다. 이러한 방식으로 농도 분포 및 수용 세포의 응답 사이에 인과 관계를 추론 할 수있다. 불행히도, 가장 일반적으로 사용되는 형광 기반 기술들의 대부분은이 기준을 충족하지 않는다. 형광 융합 단백질 승 분석에 태그를 사용할 수 있습니다셀 ithin하지만 분비 경로를 방해하거나 분비 된 경우, 정량하기 어려운 세포 외부 광선 확산을 초래한다. 형광 immunosandwich 기반 분석법은 세포 분비를 검출하기위한 가장 널리 사용되는 기술이지만 일반적으로 개별 세포의 분리를 필요로한다. 또한, 감지 항체의 도입은 일반적으로 정지 또는 실험 및 항체 레이블 크기 단부 6-11, 150 kDa의 IgG에 대한이, 다운 스트림 신호에 장애입니다.
이러한 장애물들 그 라벨없는 기술은, 화상 단백질 분비하고 기존 라벨없는 기술 사이 이용 플라즈몬 공명 (SPR)을 표면 및 국소 표면 플라즈몬 공명 (LSPR) 센서는 우수한 후보 것이 바람직하기 때문이다. 12-17 이들 센서는 널리 단백질, 엑소 좀 다른 바이오 마커 분석 결합 연구를 위해 사용되어왔다. 18 ~ 24를 저 채도, 플라즈몬 nanostr의 경우uctures 유리 커버 슬립 상에 리소그래피 패터닝 및 표준 와이드 필드 현미경 구성을 통해 가시광을 사용하여 여기 될 수있다. 인해 나노 공간에, 유리 기판의 대부분은 25-28. 이러한 살아있는 세포 현미경과의 통합에 적합 시야 잘 이러한 프로브를 만드는 형광 현미경과 같은 일반적인 영상 기술로 사용할 우리는 실시간 측정을 입증 각각 225 밀리 초와 10 μm의,의 공간과 시간 해상도 기능화 된 금 플라즈 모닉 나노 구조를 사용하여 하이 브리 도마 세포에서 항체 분비물. 기본 칩 구성은도 1에 도시되어있다. 28 현미경의 출사 광로가 이미지에 사용 CCD 카메라와 나노 구조물의 소정의 배열 분별 점유 (도 2의 정량 용 섬유 광학적 결합 분광계가 나눠 ).
protoc동시에 표준 명 시야 현미경을 사용하여 세포의 반응을 모니터링하면서 본 논문에서 제시 올 단세포 분비물의 실시간 측정을위한 실험 설계를 설명한다. 종합 접근법은 세포주의 나노 구조물의 제조, 분석 물질의 결합 친화력을위한 나노 구조물의 기능화, 모두 비 – 특이 적 결합을 최소화 및 상업적 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 운동 속도 상수의 특성 (SPR) 악기 표면 최적화, 통합이 포함 기판과 영상 및 스펙트럼 데이터를 분석 상. 우리는 세포 분비물 및 수신 세포와의 인과 관계의 시공간 매핑 가능 기술로이 기술을 기대하고 있습니다.
The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.
There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines.
The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.33 Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
25mm diameter glass coverslips | Bioscience Tools | CSHP-No1.5-25 | 170±5 µm is optimal |
Poly-methyl methacrylate | Microchem | PMMA 950 A4 | |
Ethyl lactate methyl metacrylate | Microchem | MMA EL6 | |
Electron beam evaporator | Temescal | FC-2000 | |
Electron beam lithography | Raith | Series 150 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 320110 | |
CR-7 chromium etchant | Cyantek | CR-7 | |
Scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 55 | |
Atomic force microscope | Veeco | Nanoscope III | |
Plasma ashing system | Technics | Series 85 RIE | |
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO) | Prochimia | TH 001-m8.n3-0.2 | |
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC) | Prochimia | TH 003m11n3-0.1 | |
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN) | Prochimia | TH 002-m11.n3-0.2 | |
Surface plasmon resonance system | Biorad | XPR36 | |
Bare gold chip | Biorad | GLC chip | Plasma ashed to remove the monolayer |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo | 22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo | 24510 | |
Pentylamine-Biotin | Thermo | 21345 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
Neutraavidin | Thermo | 31000 | |
Phosphate buffered saline | Thermo | 28374 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axio Observer | Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH |
CCD camera | Hamamatsu | Orca R2 | Thermoelectrically cooled (16 bit) |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65Pro | |
Spectrasuite | Ocean Optics | version1.4 | |
c-myc peptide HyNic Tag | Solulink | SP-E003 | |
monoclonal anti-c-myc antibody | Sigma-Aldrich | M4439 | |
Hybridoma cell line | ATCC | CRL-1729 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Serum free media RPMI 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
Rhodamine DHPE | Life Technologies | L-1392 |