תקשורת בין-תאית היא קריטית לשליטה בפעילות פיזיולוגית שונות בתוך ומחוץ לתא. מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידת טבע מרחב ובזמן של הפרשות תא בודדות. כדי להשיג זאת, גישה רב תחומית המשלבת משמשת nanoplasmonic ללא תווית חישה עם הדמיה תא חי.
Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.
תקשורת בין-תאית חיונית להסדרת פעילויות רבות פיסיולוגיות הן בתוך ומחוץ לתא. מגוון של חלבונים ושלפוחית יכול להיות מופרש שלאחר מכן יפעיל תהליכים תאיים מורכבים כגון בידול, ריפוי פצעים, תגובה חיסונית, הגירה, והתפשטות. 1-5 תקלות של מסלולי איתות בין-תאיים היו מעורבות במספר רבה של הפרעות, כולל סרטן, טרשת עורקים , וסוכרת, עד כמה שם.
Assay הפרשת התא האופטימלי צריך להיות מסוגל מרחב ובזמן מיפוי החלבון המופרש של עניין מבלי לשבש את מסלולי איתות הרלוונטיים. בדרך זו קשרים סיבתיים בין פרופילי הריכוז והתגובה של התאים שקיבלו ניתן להסיק. למרבה הצער, רב של טכניקות המבוסס על ניאון הנפוץ ביותר אינו עומד בקריטריונים אלה. חלבוני היתוך פלורסנט יכולים לשמש כדי לתייג אנליטי within התא אבל יכול לשבש את מסלול ההפרשה, או אם מופרש, תוצאות בזוהר מפוזר מחוץ לתא שקשה לכמת. מבחני מבוססי immunosandwich ניאון הם הטכניקות הנפוצות ביותר לאיתור הפרשות סלולריות אך בדרך כלל דורשים הבידוד של תאים בודדים. 6-11 בנוסף, כניסתה של נוגדן החישה בדרך כלל עוצרת או מסיימת את הניסוי ואת הגודל של תוויות הנוגדן, 150 kDa עבור IgG, הוא מכשול לאיתות במורד הזרם.
בגלל המחסומים אלה עדיף שטכניקה ללא תווית להיות מנוצלת להפרשות חלבון תמונה ובין טכנולוגיות ללא תווית קיימות, משטח תהודת plasmon (SPR) והתהודה plasmon פני השטח מקומית חיישנים (LSPR) הם מועמדים מצוינים. 12-17 אלה חיישנים היו בשימוש נרחב ללימודים מחייבים אנליטי של חלבונים, exosomes וסמנים ביולוגיים אחרים. 18-24 במקרה של LSPR, nanostr plasmonicuctures ניתן בדוגמת lithographically על coverslips זכוכית ונרגש באמצעות אור נראה דרך תצורות מיקרוסקופ שדה רחב סטנדרטיים. בשל טביעת רגל ננו, רוב מצע הזכוכית זמין עבור טכניקות הדמיה נפוצות כגון שדה בהיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי ביצוע בדיקות אלה גם מתאים לשילוב עם מיקרוסקופ לחיות תאים. 25-28 אנחנו הוכחנו מדידה בזמן אמת הפרשות נוגדנים מתאי hybridoma באמצעות ננו plasmonic זהב פונקציונליות עם החלטות מרחב ובזמן של 225 אלפיות שני ו -10 מיקרומטר, בהתאמה. תצורת השבב הבסיסית מתוארת באיור 1. 28 נתיב פלט האור של המיקרוסקופ הוא פיצול בין מצלמת CCD המשמשת להדמיה וספקטרומטר בשילוב סיבים אופטי-לקביעה כמותית של התפוסה החלקית של מערך נתון של ננו (איור 2 ).
Protocol מוצג במאמר זה מתאר את תכנון הניסוי למדידת הפרשות תא בודדים בזמן אמת תוך מעקב התגובה של התאים באמצעות מיקרוסקופ השדה בהיר הסטנדרטי בו-זמנית. גישה רב תחומית כוללת ייצור של ננו, functionalization של ננו לזיקה הגבוהה המחייבת של analytes, אופטימיזציה משטח לשני מכשיר מזעור מחייב שאינו ספציפי ואפיון קבועי קצב קינטית באמצעות משטח מסחרי Plasmon תהודה (SPR), שילוב של שורות תאים על גבי המצע, והניתוח של דימויים ונתוני רפאים. אנו צופים בטכניקה זו כדי להיות טכנולוגיה המאפשרת למיפוי המרחב ובזמן של הפרשות תא והקשרים סיבתיים שלהם עם תאים מקבלים.
The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.
There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines.
The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.33 Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
25mm diameter glass coverslips | Bioscience Tools | CSHP-No1.5-25 | 170±5 µm is optimal |
Poly-methyl methacrylate | Microchem | PMMA 950 A4 | |
Ethyl lactate methyl metacrylate | Microchem | MMA EL6 | |
Electron beam evaporator | Temescal | FC-2000 | |
Electron beam lithography | Raith | Series 150 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 320110 | |
CR-7 chromium etchant | Cyantek | CR-7 | |
Scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 55 | |
Atomic force microscope | Veeco | Nanoscope III | |
Plasma ashing system | Technics | Series 85 RIE | |
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO) | Prochimia | TH 001-m8.n3-0.2 | |
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC) | Prochimia | TH 003m11n3-0.1 | |
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN) | Prochimia | TH 002-m11.n3-0.2 | |
Surface plasmon resonance system | Biorad | XPR36 | |
Bare gold chip | Biorad | GLC chip | Plasma ashed to remove the monolayer |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo | 22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo | 24510 | |
Pentylamine-Biotin | Thermo | 21345 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
Neutraavidin | Thermo | 31000 | |
Phosphate buffered saline | Thermo | 28374 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axio Observer | Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH |
CCD camera | Hamamatsu | Orca R2 | Thermoelectrically cooled (16 bit) |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65Pro | |
Spectrasuite | Ocean Optics | version1.4 | |
c-myc peptide HyNic Tag | Solulink | SP-E003 | |
monoclonal anti-c-myc antibody | Sigma-Aldrich | M4439 | |
Hybridoma cell line | ATCC | CRL-1729 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Serum free media RPMI 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
Rhodamine DHPE | Life Technologies | L-1392 |