Summary
פלישת תאי סרטן השחלות לmesothelial הבטנה של הצפק היא תהליך דינמי לאורך זמן. ניצול מנתח בזמן אמת, את היכולת פולשני של תאי סרטן שחלות במודל תא שיתוף תרבות אליפטית-mesothelial ניתן לכמת על פני תקופות זמן ממושכות, המספקת תובנות גורמים המסדירים את התהליך גרורתי.
Abstract
סרטן השחלות גרורות על ידי שפיכה לתוך נוזל הצפק ופיזור לאתרי דיסטלי בתוך הצפק. תרבויות חד שכבתי במדויק לא מודל ההתנהגויות של תאי סרטן בתוך סביבת nonadherent, כמו תאי הסרטן לצבור מטבע לתוך מבנים תאיים אשר תורמים לתהליך גרורתי על ידי הצמדת ולפולש הצפק ליצירת גידולים משניים. למודל בשלב חשוב זה של גרורות סרטן שחלות, אגרגטים רב תאיים, או spheroids, יכול להיות שנוצר משורות תאי סרטן השחלות הוקמו נשמרו בתנאי nonadherent. כדי לחקות את microenvironment הצפק נתקל על ידי תאי גידול in vivo, מודל שיתוף תרבות אליפטית-mesothelial הוקם בי preformed הספרואידים הם מצופים על גבי monolayer תא mesothelial אדם, נוצרו מעל מחסום מטריקס. שיטות לאחר מכן פותחו באמצעות נתח סלולרי בזמן אמת לביצוע אמיתי כמותייםמדידות זמן של הקיבולת פולשני של שורות תאי סרטן השחלות שונות גדלו כמו הספרואידים. גישה זו מאפשרת למדידה רציפה של פלישה על פני תקופות זמן, שבו יש מספר יתרונות על פני מבחני נקודת סיום מסורתיים ותמונה מיקרוסקופית זמן אמת מפרכת יותר ניתוחים ארוכות. בקיצור, שיטה זו מאפשרת מהירה, קביעת גורמים המסדירים את יחסי הגומלין בין התאים אליפטית סרטן השחלות הפולשים דרך מחסומי mesothelial ומטריצה לאורך זמן.
Introduction
יש לו סרטן השחלות שיעור התמותה הגבוה ביותר מכל סוגי סרטן גינקולוגיות 1. ברחבי העולם, יש ~ 230,000 מקרים ומעל 100,000 מקרי מוות כתוצאה מהמחלה בכל שנה 1. רוב המטופלים (> 75%) מאובחנים לאחר הסרטן כבר שלח גרורות, כאשר הטיפול הוא מסובך עוד יותר על ידי התנגדות מוגברת לכימותרפיה והתחזית היא ענייה 2. יש חולים עם מחלה גרורתית III-IV שלב שיעורי הישרדות לאחר 5 שנים של רק 30-40% 3. לפיכך, יש צורך דחוף בהבנה טובה יותר של ההתנהגויות הסלולר שבבסיס גרורות סרטן השחלות על מנת לטפל במחלה מתקדמת בצורה יעילה.
המודל הנוכחי של גרורות סרטן השחלות מציע כמה שלבים בתהליך גרורתי, כל אחד מהם מתרחש בmicroenvironment שונה אשר משפיע על גידול התנהגות. תאי סרטן השחלות גרורות לראשונה להשיל מאתר הגידול הראשוני ולשרוד בnonadherמדינה אף אוזן גרון בתוך נוזל הצפק כתאים בודדים או מבנים תאיים תלת ממדים, המכונה אגרגטים או הספרואידים 2,4,5 רב תאיים. תאים אשר אינו מהווים הספרואידים בהשעיה רגישים יותר לanoikis 2,4,5. Spheroids גם תערוכה עלה התנגדות chemotherapeutics, תורם למחלה שיורית וההישנות הבאה של 2,4,5 הסרטן. שלב קריטי שני בגרורות סרטן השחלות הוא המעבר של אגרגטים מאשכולות חופשיים צף לגידולים משניים שהוקמו בתוך הקיר וomentum 5,6 הצפק. תאי תאי אינטראקציות ותא מצע היו מעורבות בהיווצרות המצרפי, הישרדות, ודבקות במטריצה תאית (ECM) המיוצרת על ידי mesothelial רירית 4-11 הצפק. עדיין, התהליכים האלה הם הבינו היטב.
כדי להגדיר את המנגנונים מעורבים בהפצה של סרטן השחלות, הספרואידים יכולים להיות generated משורות תאי הסרטן שהוקמו תוך שימוש בשיטות תרבות nonadherent, שמירה על תאים בתרחיף או על ידי הוספת methylcellulose לתקשורת תרבות 12,13 או על ידי תאי culturing על צלחות נמוכות מצורפים 2,14. כאשר בתרבית באופן זה, תאי סרטן השחלות יותך אגרגטים או spheroids תאיים שתערוכת תכונות סלולריות, מולקולריות, ויוכימיים דומות לאלו של אגרגטים גידול נמצאו בvivo 2,14. לאחר היווצרות, הספרואידים ניתן לקצור מאוחר יותר ממדיום nonadherent וreplated על גבי מגוון רחב של משטחים מוצקים ללימודים תפקודיים נוספים. זה מייצג מראש על מבחני בתרבות monolayer, שלא במדויק מודל ההתנהגויות של תאי סרטן שחלות גרורות בתוך סביבה nonadherent כגון נוזל intraperitoneal.
הקיבולת פולשני של הספרואידים סרטן ניתן להעריך במבחני נקודת סיום מסורתיים בבוידן תאים 2 15,16; עם זאת, ניתוח נתוני זמן לשגות זה זמן רב ויכול להיות סובייקטיבית. בזאת, שיטה מהירה, כמותית להערכת ההתנהגויות פולשני של spheroids סרטן השחלות בזמן אמת הוא תאר. ראשית, מודל תא אליפטית-mesothelial הוקם המייצג את השלב של גרורות סרטן השחלות כאשר הספרואידים תאיים לצרף ולפלוש הצפק ליצירת גידולים משניים. אז מתודולוגיה למנתח בזמן אמת נייד (RTCA; ראה טבלת חומרים לפרטים חברה) הותאמה לביצוע מדידות בזמן אמת כמותי של היכולת פולשנית של שורות תאי סרטן השחלות שונות גדלו כמו הספרואידים ונבדקו במודל זה.
בRTCA במחוונים, תגובות הסלולר נמצאות תחת פיקוח ברציפות במהלך assay, ללא הצורך בתוויות חיצוניות, על ידי מדידת שינויים בעכבה חשמלית. יש צלחות תרבות שתוכננו במיוחד microelectrodes מצופה זהב שנמצא מתחת קרום microporous בממשק שבין התאים העליונים ותחתונים של 2 (צלחות 'CIM') תאיים כן. המיקום של האלקטרודות בתא התחתון מאפשר מדידה של שינויים בעכבה חשמלית כמו תאים לפלוש דרך ECM או ECM / מחסום סלולארי. ממשק הקרום בין 2 התאים של כל אחד גם צלחת CIM מצופה ראשית עם רכיב ECM של עניין. במערכת המודל של תאים אליפטית-mesothelial, הממשק הוא מצופה בשכבה של Matrigel (ראה טבלת חומרים לפרטים חברה), לחקות את ECM המורכב שבבסיס mesothelial הבטנה של הצפק, ואחריו monolayer מחוברות של mesothelial אדם " תאי יעד '. לבסוף, spheroids סרטן השחלות מראש יצר הם מודעותטוליפ אין. תאים אליפטית סרטן השחלות פעיל חייבים לפלוש דרך שכבת תאי היעד ומטריקס להגיע לחדר התחתון ולשנות קריאות עכבה חשמליות. תאי מטרה בכוחות עצמם גם נבחנים כדי לוודא שהם לא לפלוש דרך שכבת מטריקס ומתאימים לשימוש בassay זה.
Protocol
1. הכנת התאים, מדיה, וריאגנטים
- הכנת בינונית המכיל Methylcellulose
- ממיסים 1.5 גרם של methylcellulose בשל הנשר בינוני של Dulbecco סטרילי השונה (DMEM) (ללא תוספים) 100 מיליליטר בבקבוק 250 מיליליטר.
- מחממים את הפתרון על נמוך במיקרוגל במשך 5 דקות; לטפל כדי למנוע רותח מעל.
- ברגע שאבקת methylcellulose היא חצי מומסת, להוסיף בוחש נקי מגנטי ותקשורת לקחת את עוצמת הקול ל125 מיליליטר.
- לערבב, להפוך, ומערבבים בטמפרטורת חדר למשך 1.5 שעות, ואחריו על ידי ערבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- מחלקים את הפתרון באופן שווה לארבעה 50 צינורות מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 1.5 שעות ב2,300 x גרם.
- לאסוף את supernatant ברור, צמיג מאוד (כ 90-95% ממניות), aliquot לתוך 50 צינורות מיליליטר סטרילי, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
- תרבות וסימון של תאים
- לשמור על שורות תאי סרטן השחלה בmonolayer בtiחממת תרבות ssue על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתקשורת צמיחה המתאימה (DMEM לתאי KGN 17 וMCBD110: M199 לקווי OVCA429 וOVCA433 תא 18) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ L -גלוטמין, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין.
- שמור על תאים אנושיים mesothelial LP9 בM199: תקשורת F12 כרעיים המכילה FBS 15%, 10 ng / ml עוריות Growth Factor (EGF) ו400 הידרוקורטיזון מיליליטר / ng, בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- תאי זרע בגודל הבקבוק הרצוי ולגדול לכ confluency 75%. קציר תאים על ידי trypsinization באמצעות 0.05% טריפסין / EDTA, ספין ב186 XG במשך 5 דקות, ולשטוף את התא גלולה פעמיים עם PBS.
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
- שיטת תיוג תא פלורסנט אופציונלית
- תאים סרטניים resuspend בריכוז סופי של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר ב 1 מיליליטר של BSA% PBS/0.1 prewarmed.
- הוסף 2 μl 5 תא מניית Tr מ"מפתרון אס CSFE (או תווית תא מועדפת אחרת הנשמרת לטווח ארוך) לתאים בריכוז סופי של 10 מיקרומטר ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות בwaterbath.
- להרוות את התגובה עם 1 מיליליטר של מדיום קר כקרח מכיל 10% FBS מחדש גלולה ידי צנטריפוגה. Resuspend ב 10 מיליליטר של מדיום גידול prewarmed המתאים (ראה שלב 1.2.1).
- תאי זרע ל2 בקבוק 75 סנטימטר הכתיר מסנן ותרבות על 37 מעלות צלזיוס, CO 2 של 5%.
- בדקו תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שרמת הקרינה של תיוג היא נאותה לצורך זיהוי. ברגע שהתאים מגיעים כ 75% confluency, קציר ולספור כמו ב1.2.3 צעדים ו1.2.4 לעיל.
2. דור של spheroids בMethylcellulose
- חישוב הנפח של תאי סרטן שחלות מסעיף 1 הנחוץ לדור אליפטית (כולל של 300,000 תאים נדרשים לכל ניסוי 96 גם צלחת מלאה). לאטה: אם באמצעות שורות תאים שונות מכפי שהוצג כאן, צפיפות תאים לדור אליפטית אחיד ייתכן שתצטרך להיות מותאמת לכל שורה.
- כדי לחשב דילול של תאים בתקשורת methylcellulose, ראשית לחסר התא הנדרש (שלב 2.1) מ15 מיליליטר הנפח.
- הוסף 3 מיליליטר של פתרון מניות methylcellulose (כדי להפוך 20% methylcellulose סופיים) להיקף מתאים מדיום תרבות עבור כל קו תא, שווה ל15 מיליליטר מינוס נפח התא ומערבבים היטב על ידי היפוך עדין.
- הוספת 300,000 תאים למדיום methylcellulose המכיל ומעורב באופן יסודי על ידי היפוך עדין.
- פיפטה 150 μl של תמהיל תא / methylcellulose / מדיה (עבור סכום כולל של 3,000 תאים / טוב) לתוך באר כל צלחת 96 היטב קעורה תחתונה תרבות ותרבות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 1-4 ימים או עד הספרואידים אחידים יוצרים (אליפטית 1 / גם הוא ציין בדרך כלל).
3. נייד RTCA מבחני פלישה
איןTE: קריאות עכבה באות לידי ביטוי כתא מדד (CI), פרמטר חסר ממדים המהווה שינוי יחסי בעכבת תא נמדד מייצגת את מצב התא. לצורך הניתוח, לייבא נתונים לגיליון אלקטרוני, כגון Microsoft Excel.
- הכנת צלחת
- עבודה בקבוצות של 4 בארות בכל פעם, להוסיף מטריצת 50 μl (בדילול מלא 1:10 ב תקשורת ותרבות בסרום ללא) היטב בכל החדר העליון של צלחת 16 היטב RTCA CIM כדי להבטיח שסך שטח הפנים מכוסה . הסר 30 μl של מטריקס באופן מיידי, אבל לאט לאט, כדי להיפטר מכל נוזלים עודפים.
- דגירה צלחת ב37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפני השימוש בתרבית רקמת חממה.
- הוסף 30 μl של מדיום הסרום ללא (SFM) מתאים לכל שורת תאי סרטן לחדר העליון ו160 μl של תקשורת עם או בלי סרום (כמו לכל עיצוב ניסיוני שלך) לתא התחתון.
- להרכיב את צלחת CIM על ידי לחיצה על התא התחתון לתא וequilibr העליוניםאכלתי ב37 ° C חממה במשך שעה 1 בתרבית רקמת חממה.
- תכנות מכשיר RTCA
- פתח את תכנית RTCA ובחר בכרטיסייה 'הפריסה'. סמן את כל הבארות הניסיוניות.
- לחץ לחיצה ימנית על בארות ובחר 'הפעל בארות'; לאחר מכן למלא בתנאי ניסוי ותא שמות כרצונכם.
- כדי להוסיף שלבים או צעדי ביניים לתכנית, בחר בכרטיסייה 'לוח זמנים' ולחץ לחיצה ימנית על 'הוסף שלב'. הצעד הראשון הוא לטאטא רקע מתוכן מראש, אשר שולב באופן אוטומטי לתכנית פעם אחת 'להוסיף צעד' נבחר.
- הזן את פרטי תכנית הרצויים עבור שלב 2 של תכנית RTCA, אשר תתעד קריאות במהלך הקמת monolayer LP9. מוסיף את מרווחי הזמן בין קריאות עכבה על ידי בחירת הכרטיסייה 'המרווח "והזנת '15 דקה'. הוספת משך ניסוי על ידי בחירת הכרטיסייה 'משך'נכנסים ד זמן בין 12-24 לשעה.
- כדי להוסיף שלבים שלאחר מכן, בחר בכרטיסייה 'לוח זמנים' ולחץ לחיצה ימנית על 'הוסף שלב' והזן את הפרטים של צעדים נוספים, כאמור לעיל. שלב 3 של תכנית RTCA ינחה את המכשיר כדי לקחת קריאות במהלך פלישת אליפטית; הכנס דקות '5 'תחת' שעה הכרטיסייה ו'48 'המרווח תחת לשונית' משך '.
- בחר "פלייט" בשורת התפריטים ולשמור.
- דור של LP9 חד שכבתי ומדידה של אליפטית פלישה
- מניחים צלחת CIM במכשיר RTCA ותכנית פתוחה משלב 3.2 לעיל. לפני הוספת תאים, בחר 'ביצוע' בשורת תפריטים ולאחר מכן על "התחל". לטאטא רקע באופן אוטומטי שבוצע (שלב 1 בהוראות תוכנת RTCA).
- הסר את צלחת CIM מהמכשיר הבא לטאטא רקע והמקום במכסת מנוע בתרבית רקמה.
- 50,0 פלייט00 LP9 תאים תלויים ב160 μl SFM לתוך התא העליון של כל צלחת CIM כן.
- מניחים את הצלחת במכשיר RTCA ולקחת קריאות כל 15 דקות תוך monolayer LP9 מקים לילה (שלב 2 של תכנית RTCA).
- הספרואידים סרטן קציר שנוצרו תחת שלב 2 'דור של הספרואידים בmethylcellulose', לעיל.
- סביבה נקיה מחיידקים, לחתוך 1 מ"מ את החלק העליון של קצה פיפטה 1 מ"ל ולהשתמש בו כדי לאחזר בעדינות את תוכנו של כל אחד. מעביר צינור סטרילי.
- צנטריפוגה spheroids ב120 XG במשך 8 דקות, ולהסיר בינוני methylcellulose המכיל על ידי שאיפה עדינה.
- שטוף הספרואידים עוד פעמיים עם PBS, צנטריפוגה ב120 XG במשך 8 דקות עד גלולה הספרואידים לאחר כל שטיפה.
- לכל אחד גם ניסיוני, resuspend כולל של 10 הספרואידים ב160 μl של מדיום בלי FBS.
- להשהות את ניסוי RTCA על ידי בחירה "הפעל" משורת התפריטים ובדיקה &# 8216; השהה '. הסר את צלחת CIM מהמכשיר, ואת המקום במכסת מנוע בתרבית רקמה. לשאוב את התקשורת מכל טוב ולהחליף עם תקשורת המכיל אליפטית (10 תחומים 160 μl) או תקשורת טרי לבארות שליטה LP9 בלבד.
- להחזיר את הצלחת למכשיר RTCA. בחר 'הפעלה' משורת התפריטים ולבדוק 'בטל צעד'. התכנית תעבור לצעד הבא באופן אוטומטי. כדי לחדש את הניסוי, בחר 'ביצוע' משורת התפריטים ולבדוק "התחל / המשך '. שלב 3 בתכנית RTCA ייזום.
- ניתוח נתונים
- כדי לקבוע את רמת הפולשנות של תאים אליפטית, לחסר הערכים שהתקבלו עבור monolayer LP9 רק מהקריאות בודדות שהתקבלו לשורות תאי סרטן השחלות בכל timepoint.
- כדי להתוות 'פלישה אליפטית', לנרמל את כל הערכים עד לנקודת הזמן שבי הספרואידים נוספו לצלחת, על ידי יםetting שנקודת הזמן '0 '.
Representative Results
יכול להיות שנוצר מסוגים רבים של שורות תאי סרטן השחלות spheroids ידי culturing אותם בהשעיה או על ידי איסוף תאי גידול ראשוניים ממיימת הממארת 2,14. הנה שני קווי אפיתל השחלות תא סרטני, OVCA433 וOVCA429, ושורת גידול תא granulosa השחלות, KGN, שנוצלו כדי ליצור spheroids (איור 1 א). בשיטה זו, תאים בתרבית בבארות תחתית-U בזמן תלוי בתקשורת המונית שנעשתה צמיג על ידי התוספת של methylcellulose. בתנאים אלה, רבים תאי סרטן השחלות מפגינים יכולת טבועה כדי לצבור כדי ליצור הספרואידים 13. בעקבות תרבות הלילה התלויה בmethylcellulose / תקשורת, כל שלוש שורות התאים שנוצרו מבני אליפטית קומפקטיים של כ 400-500 מיקרומטר קוטר (איור 1 א). בינתיים, צלחת RTCA CIM מוכנה, ראשית על ידי ציפוי ממשק הקרום הנקבובי עם מטריצה ולאחר מכן monolayer מחוברות של mes אדםתאי othelial (איור 1). לאחר מכן יצרו פעם אחת, הספרואידים מועברים לצלחת CIM מוכנה. הספרואידים סרטן נקטפו הם מצופים בחלקו העליון של monolayer LP9 והוערכו כמתואר להלן. תמונות תחת מיקרוסקופ רגיל שלב (או תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אם צעד תיוג תא האופציונלי אחרי) של תרבויות מקבילות נלקחות מעת לעת כדי לסייע בפרשנות של נתוני RTCA (תרשים 1C).
זה הוא אינפורמטיבי להעריך גם את רמת הבסיס של פלישה של שורת תאי סרטן, כמו גם פלישה-Induced chemoattractant. בדרך כלל, הפולשנות הבסיסית נמדדת על ידי התוספת של SFM לשני תאים העליונים ותחתונים. תקשורת מלאה (10% FBS), שמכיל הרבה chemoattractants פוטנציאלי, משמש בדוגמא הנוכחית לבחון פלישה 'מושרה chemoattractant' (איור 2). מחקרים מקבילים של תאי mesothelial LP9 לבד אישרו כי תאים אלה הם מינימאלי בvasive מעל 2 ימים מתחת או בסל או 'chemoattractant' תנאים מושרה ובכך היו סוג תא טוב לשימוש במבחני התרבות משותפת עם תאי סרטן שחלות (2A דמויות ו2B). לעומת זאת, spheroids סרטן השחלות שנוצר תוך שימוש בכל אחת משלוש שורות התאים הציג את היכולת לפלוש לכיוון chemoattractant (איורים 2 א-2C) (FBS). היתרון העיקרי של שימוש במכשירים בזמן אמת RTCA על מבחני נקודת סיום מסורתיים הוא ששינויים בתא / אליפטית התנהגות ניתן לכמת לאורך זמן. במהלך assay 2 היום, כל KGN, OVCA429, ושורות תאי OVCA433 הציגו את היכולת לפלוש לכיוון chemoattractant (מסומן על ידי הגדלת מדדי תא) אך רמות בסיס נמוכות של פלישה (איור 2 ג). שורות התאים הציגו שיעורים דומים של פלישה, כפי שצוין על ידי המדרונות המקבילים של העקומות (איור 2 ג); לעומת זאת, עקום OVCA429 הציג אסימפטוטה העליונה גבוהה יותר,אשר הצביע על רמה מקסימלי גבוהה יותר של פלישה בהשוואה לשורות תאים האחרות. יתר על כן, שורות התאים הציגו הבדלים בזמנים שלהם לתחילתה של פלישה, עם תאי KGN פולשים במהירות את המחסומים הניידים ומטריקס וOVCA433 וOVCA429 תאים לוקחים 3-5x כבר לפלוש, בהתאמה (איור 2 ד). חשוב מכך, ההתנהגות שלהם בתחילת הפלישה לא היתה חזויה של הקיבולת הכוללת שלהם לפלישה (2C דמויות ו2 ד). הדבר מצביע על יכולות הגלומות שונות של שורות תאי הסרטן, אלא גם עשוי להצביע על כך גורמים שונים עשויים לווסת את ההתנהגויות פולשנית מוקדמות ומאוחרות של הספרואידים.
איור 1 דור ומודל אליפטית של ניסיון להגדיר:.. אני המגים תחת מיקרוסקופ לעומת שלב של הספרואידים להרכיב בmethylcellulose / תקשורת (למעלה) ושל הקו הסלולרי התואם גדל כמו monolayer (תחתון) B:. סכמטי המציג את RTCA 2 תאיים צלחת CIM להגדיר היטב, שבו נוצרה מראש סרטן השחלות הספרואידים הם מצופים על גבי monolayer של שכבה / מחסום LP9 mesothelial מטריקס בחדר העליון ותקשורת ± FBS כchemoattractant מתווסף לתא התחתון. אלקטרודות מתחת לממשק של מדד 2 תאי הגדלת עכבה חשמלית ככל שיותר תאים לפלוש דרך המחסומים לתא C הנמוך:. תמונות של הספרואידים KGN על גבי monolayer LP9 תחת מיקרוסקופ שלב הניגוד (משמאל) או מיקרוסקופ פלואורסצנטי (מימין). ברים סולם = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עבור: together.within-לשמור על עמודים = "תמיד"> 
.. איור 2 נתונים פלישה אליפטית סרטן השחלות בזמן אמת - ב ': תוצאות נציג מassay פלישת RTCA שנערך עם וללא FBS בתא התחתון של צלחת CIM כן. פלישת תא KGN היא בהשוואה לתאי mesothelial LP9. תוצאות מוצגות כממוצע ± SD סלולרי אינדקס מבארות בשלושה עותקים בtimepoint שעה 24 () ועל פני תקופה כל assay יומיים (ב ') C - D:. השוואה של הקיבולת פולשני של KGN, OVCA429, ותא OVCA433 קווים מצוירים על פני תקופה hr 24 (C) ובאופן מפורט יותר על פני תקופה 2.5 hr זמן (ד ').
Discussion
תאי סרטן השחלות פולשים אינטראקציה עם מגוון רחב של סוגי תאים על פני השטח של הצפק, כוללים fibroblasts, adipocytes, ותאי mesothelial, והוא חשב שתקשורת דו כיוונית בין התאים הסרטניים ותאי הצפק כדי לשחק תפקיד מפתח בהנעת התהליך גרורתי 2. ברגע שמשתלט עליו, הפרוטוקול המתואר במסמך זה הוא בקלות להתאמה לחקר האינטראקציות הללו בתוך microenvironment הצפק, למשל, באמצעות התוספת של ציטוקינים אקסוגניים, גורמי גדילה, או מעכבים ספציפיים לתאי העליונים או תחתון של צלחת CIM טובה או מניפולציה גנטית של הסרטן או שורות תאי הצפק. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש בתאים סרטניים בשחלות עיקריות שנקטפו זה עתה ממיימת הממארת ו / או תאים ראשוניים של הצפק כדי לקבל תובנות ישירות לאותות רגולציה ואינטראקציות הסלולר המסדירות את הקמתה של נגע גרורתי בחלל הצפק שימוש במכשיר RTCA כדי למדוד את הקיבולת פולשני של תאים או הספרואידים אחד מציע מספר יתרונות על פני מבחני קונבנציונליים אחת נקודות קצה וזמן לשגות תמונת מנתח. המכשיר מודד RTCA פלישה סלולרית במרווחי זמן מוגדרים ברציפות במהלך assay, אשר יכולות להיות שעות או ימים. זה מאפשר קביעת שינויים בשער של פלישה לאורך זמן, שמתגבר על המגבלות של מבחני נקודת סיום אחת. כך, למשל, בוחן את נתוני פלישה משורות תאי הסרטן השונים בנקודתי קצה אחד (איור 2), למשל, 3 שעות, היה עשויים להוביל למסקנה המוטעית כי KGN וOVCA433 תאים היו הרבה יותר פולשנית מאשר OVCA429 תאים. יתרון נוסף של טכנולוגיה זו הוא כי מכשיר RTCA מודד את השינויים בעכבה חשמלית. משמעות דבר היא כי מבחני ניתן להפעיל ללא תיוג תאים עם סוכן חיצוני, אשר עשוי להיות השפעות בלתי צפויות על פן תאotype או פונקציה. זה הופך להיות חשוב במיוחד כאשר לומדים תאי סרטן השחלות עיקריים הנגזרים ממיימת הממארת, שבה היא הכרחי כדי לשמור על מניפולציות למינימום כדי למנוע החדרת שינויים מולקולריים ופנוטיפי שאינם משקפים את האופי שלהם in vivo 2. יתר על כן, שימוש במכשיר RTCA מאפשר האיסוף של נתונים כמותיים בזמן אמת, שלא רק ימנע את הזמן רב ניתוחים הקשורים למיקרוסקופיה זמן לשגות, אלא גם מאפשר הקביעה המהירה של חלונות הניסיונית מפתח עבור assay אופטימיזציה. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר משווה את ההשפעות של מגוון גורמים בפלישת אליפטית, גורמים שונים כיכולים להפעיל את ההשפעה המקסימלי שלהם בנקודות זמן שונים, או עם פרופילים שונים באופן משמעותי לאורך זמן. למרות שפרוטוקול זה ניתן לשינויים (לדוגמא, שימוש במטריצה שונה ECM, שורות תאי הסרטן שונות, או cel היעד שונהls), אם כך, חשוב לציין כי תנאי ניסוי שונים צריכים קודם להיות מותאמים. לדוגמא, לפני תחילת לימודים של פלישת אליפטית, המספר האופטימלי של תאים סרטניים / צלחת CIM גם צריך קודם כל שייקבע על ידי assay של titrations מספר התא בתרבות שכבה. המספר האופטימלי של הספרואידים להשתמש לכל טוב אז המבוסס על ניתוח זה. לדוגמא, בשיטה הנוכחית, הספרואידים מהווים כ 3,000 תאים כל אחד כאשר נוצרו ראשון. אם titrations מספר התא הראשוני עולה כי 30,000 תאים בmonolayer הם אופטימליים לזיהוי בפלישת מנתח, אז 10 הספרואידים מתווספים לכל צלחת CIM כן. יתר על כן, בעת ביצוע ניסויי תרבות משותפת, חשוב ללמוד את ההתנהגויות של monolayer התא 'היעד' בנפרד על מנת לקבוע אם תאים אלה מטבעם פולשניים, כמו זה יכול לבלבל את התוצאות. בדוגמא שהפגינה, הספרואידים סרטן הם מצופים בחלקו העליון של תא monola LP9yer, עם ובלי FBS מתווסף לתחתית גם chemoattractant. במקביל, תאים בתרבית LP9 לבד, מתחת לכל מצב טיפול. באופן דומה, כאשר לומדים את הקיבולת פולשני של תאים והספרואידים, חשוב גם לבחון את יכולות הנדידה שלהם, כמו גם על מנת להבחין בין שתי ההתנהגויות (כלומר פלישה דורשת עיכול מפרקי החלבונים של מחסום ECM תוך הגירה לא). כדי לעשות זאת, ישמיט את מחסום ECM (שלבי 3.1.1 - 3.1.3) ולנהל את assay במקביל למחסום ECM במקום. המדד 'הפלישה' האחרון יכול להיות מתוקן למידה 'הנדידה' לשעבר, אם תרצה בכך. לבסוף, חשוב לציין כי המידע שנצבר מאמצעים של עכבה חשמלית הוא מוגבל בהיקפה: ברגע שהתאים פלשו לתוך התא התחתון, שינויים בהתקשרות שלהם, מתפשט, והתפשטות בחלק התחתון של הקרום עשויים לתרום לשינויים ב ריאה עכבה dings. לכן, במתודולוגיה זו היא אינפורמטיבי ביותר הפועל בשיתוף עם מבחני אחרים של כדאיות אליפטית תא, הדבקה, הגירה, ומורפולוגיה על מנת להעריך באופן מקיף התנהגויות תא אליפטית. לדוגמא, באופן אידיאלי, על מנת להבין באופן מלא אינטראקציות אליפטית-mesothelial, צריכים גם להיות צילמו שיתוף תרבויות נפרדות מעת לעת תחת מיקרוסקופ שלב הסטנדרטי, כך שהערכות איכותיות של מורפולוגיה אליפטית ובריאות יכולות להתבצע במקביל למבחני RTCA כמותית של פלישה. אם שלב התיוג האופציונלי מתבצע, אז ההתנהגויות של תאים סרטניים בודדים ניתן לקבוע תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כפי שהם disaggregate מאליפטית ואינטראקציה עם תאי mesothelial ללא תווית. יתרון נוסף של fluorescently תיוג תאי הסרטן כאשר שיתוף culturing עם סוג תא שני הוא שאז זה אפשרי כדי לוודא שרק תאי הסרטן פלשו דרך המחסומים הניידים וECM. > לסיכום, שיטה זו מייצגת ניתוח כמות תפוקה גבוהה של פלישה אליפטית סרטן השחלות של מחסומי mesothelial וECM. באמצעות התוספת של ציטוקינים אקסוגניים, גורמי גדילה, או מעכבים ספציפיים לתאי העליונים או תחתון של צלחת CIM גם, שיטה זו מאפשרת מהירה, קביעת גורמים המסדירים את יחסי הגומלין בין התאים אליפטית סרטן השחלות הפולשים דרך mesothelial ומחסומי מטריצה מעל זמן.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן לאומית למדע קאס והרפואה גרנט; (MB); מועצה לאומית לבריאות ומחקר הרפואי של אוסטרליה פרויקט גרנט (KLS, 338,516); ועל ידי תכנית תמיכת תשתיות התפעולית של הממשלה ויקטוריאני (אוסטרליה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4,000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
References
- Ferlay, J., et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN. Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).
- Ahmed, N., Stenvers, K. Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, (2010).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression. Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J Transl Med. 4, 6 (2006).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers. Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).
- Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro. Ann Anat. 193, 181-184 (2011).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, (2012).
- Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis. J Vis Exp. (60), (2012).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Nishi, Y., et al. Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology. 142, 437-445 (2001).
- Xu, F., et al. The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression. Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).
