腹膜の中皮ライニングに卵巣癌細胞の浸潤は、時間とともに動的なプロセスである。実時間分析器を利用して、回転楕円体、中皮細胞の共培養モデルにおける卵巣癌細胞の浸潤能は、転移のプロセスを調節する因子への洞察を提供し、長期の期間にわたって定量化することができる。
卵巣癌は、腹膜流体中に流しや腹膜内遠位部位に分散させることにより転移する。癌細胞は本質的に付着し、二次腫瘍を形成するために、腹膜内層に侵入することにより、転移過程に寄与する多細胞構造に凝集として単層培養物を正確に、非接着性環境内での癌細胞の挙動をモデル化しない。卵巣癌転移、多細胞凝集物、またはスフェロイドのこの重要な段階をモデル化するために、非付着条件下で維持確立卵巣癌細胞株から生成することができる。 インビボでの腫瘍細胞で検出された腹膜微小環境を模倣するために、回転楕円体、中皮共培養モデルを確立したスフェロイドを予め形成する細胞外マトリックス上に形成されたバリアヒト中皮細胞単層の上にメッキされる。方法は、次いで、定量リアルタイムに行うことリアルタイムの細胞分析装置を使用して開発されたスフェロイドとして増殖させ、異なる卵巣癌細胞株の浸潤能の時間測定値。このアプローチは、従来のエンドポイントアッセイおよび顕微鏡画像解析より面倒即座に勝るいくつかの利点を有する長期間にわたって浸潤の連続測定を可能にする。要するに、この方法は、時間をかけて、中皮およびマトリックスの障壁を通って侵入する卵巣癌細胞スフェロイドとの間の相互作用を調節する因子の迅速な判定を可能にする。
卵巣癌は、婦人科の癌のすべての1の最も高い死亡率を有する。世界的に、〜23万例や疾患による10万人以上の死亡者は毎年1があります。癌が既に転移した後の治療は、化学療法に対する耐性の増加によってさらに複雑であり、予後は2悪い場合ほとんどの患者(> 75%)は、診断されている。ステージIII〜IVの転移性疾患の患者だけ30から40パーセント3の5年生存率を持っている。従って、効果的に進行した疾患を治療するために、卵巣癌転移の基礎となる細胞挙動のより良い理解のために緊急の必要性がある。
卵巣癌転移の現在のモデルは、腫瘍の行動への影響の異なる微小環境で発生し、その各々の転移過程でいくつかのステップを提案する。転移性卵巣癌細胞が最初に原発腫瘍部位から脱落し、nonadherで生き残るされる単一細胞または三次元多細胞構造のような腹膜液内のENT状態は、多細胞凝集体またはスフェロイド2,4,5と称される。懸濁液中のスフェロイドを形成しない細胞がアノイキス2,4,5の影響を受けやすくなります。スフェロイドも残存病変やがん2,4,5のその後の再発に貢献し、化学療法への抵抗の増加を示す。卵巣癌転移の第二の重要なステップは、腹膜壁と大網5,6内で確立二次腫瘍に自由に浮遊クラスタから凝集体の遷移である。細胞-細胞および細胞-基質相互作用は凝集体の形成、生存および腹膜4月11日の中皮ライニングによって生成細胞外マトリックス(ECM)への接着に関与している。まだ、これらのプロセスは、ほとんどわかっていない。
卵巣癌の普及に関与するメカニズムを定義するには、スフェロイドはGENERすることができますated培養培地12,13にメチルセルロースを添加することによって、又は低付着性プレート2,14上で細胞を培養することによりいずれかの懸濁液中の細胞を維持し、非接着性の培養方法を用いて確立された癌細胞株から。このようにして培養した場合に、卵巣癌細胞は、 インビボで見出さ2,14腫瘍の凝集体と同様、細胞、分子および生化学的特性を示す多細胞凝集体またはスフェロイドへと集合する。形成された後、回転楕円体は、その後非付着性培地から収穫することができ、更なる機能的研究のための種々の固体表面上に再播種し。これは正確な腹腔内液のような非接着性の環境内転移性卵巣癌細胞の挙動をモデル化していない単層培養でのアッセイ、以上の進歩を表す。
癌スフェロイドの侵入能力は、ボイデンチャンバー2内の伝統的なエンドポイントアッセイで評価することができる</su卵巣癌細胞の浸潤が経時的に動的なプロセスであるように、p>が、このアプローチは、誤解を招くことができる。最近のリアルタイム方法は、卵巣癌スフェロイドを15,16に侵入することにより、中皮細胞クリアランスのタイムラプスビデオ顕微鏡を用いてなされたものであり;しかしながら、時間経過のデータの分析は時間がかかり、主観的であることができる。ここで、実時間における卵巣癌スフェロイドの侵襲的挙動を評価するための迅速で定量的な方法が記載されている。まず、回転楕円体、中皮細胞モデルは、多細胞スフェロイドに接続し、二次腫瘍を形成するために、腹膜ライニングに侵入する際、卵巣がんの転移の段階を表す設立されました。次いで、リアルタイムセルアナライザー(RTCA、会社の詳細については材料の表を参照)のための方法論は、スフェロイドとして増殖させ、異なる卵巣癌細胞株の浸潤能の定量的リアルタイム測定を実施するように適合され、このモデルにおいて試験した。
RTCA中でのインストゥルメント、細胞応答は、電気インピーダンスの変化を測定することによって、外因性の標識を必要とせずに、アッセイの過程にわたって連続的に監視される。特別に設計された培養プレートを2ウェルチャンバー(「CIM」プレート)の上部及び下部チャンバーの間の界面で微多孔膜の下に位置する金被覆の微小電極を有する。細胞は、ECMまたはECM /携帯障壁を侵入するように、下部チャンバー内の電極の位置は、電気インピーダンスの変化を測定することができる。各CIMプレートのウエルの2室間の膜界面は、まず、目的のECM成分でコーティングされている。スフェロイド中皮細胞モデル系において、インターフェースは、「ヒト中皮のコンフルエントな単層を、続いて、腹膜の中皮ライニングの根底にある複雑なECMを模倣するために、(会社の詳細については、材料表を参照)マトリゲルの層で被覆されているターゲット '細胞。最後に、予備形成された卵巣癌スフェロイドは広告ですDED。卵巣癌スフェロイド細胞が活発に下部チャンバーに到達し、電気インピーダンス測定値を変化させるために、標的細胞膜及びマトリックスを介して侵入しなければならない。自分で標的細胞はまた、それらがマトリックス層を通って侵入し、このアッセイにおいて使用するのに適していないことを保証するために評価される。
侵入卵巣癌細胞は、線維芽細胞、脂肪細胞及び中皮細胞を含む、腹膜の表面に種々の細胞型と相互作用し、癌細胞と腹腔細胞との間の双方向通信は、転移プロセス2を駆動する際に重要な役割を果たしていると考えられている。一度習得し、本明細書に記載されるプロトコルは、腹膜微小環境内のこれらの相互作用の研究に容易に適応可能である、 例えば 、外因性のサイトカイン、成長因子、またはCIMウェルプレート又は遺伝子操作の上側または下側のチャンバーに特異的阻害剤の添加を介して腹膜癌または細胞株の。さらに、この方法は、腹腔内の転移性病変の確立を支配する調節シグナルおよび細胞間相互作用に直接洞察を得るために、悪性腹水および/または原発性腹膜細胞から新たに採取した原発性卵巣腫瘍細胞を使用することができる<s> 2まで。
単一細胞またはスフェロイドの浸潤能を測定するためのRTCA機器を使用することにより、従来の単一のエンドポイントアッセイおよびタイムラプス画像解析に比べていくつかの利点を提供しています。 RTCA機器は、数時間または数日間ことができるアッセイの過程にわたって連続して定義された間隔で細胞浸潤を測定します。これは、単一のエンドポイントアッセイの限界を克服し、経時的浸潤率の変化の決定を可能にする。例えば、単一のエンドポイント( 図2)での異なる癌細胞株からの侵略データなどを調べて 、3時間後には、KGNとOVCA433細胞がOVCA429細胞よりもはるかに侵襲的だった、誤った結論につながっている可能性があります。この技術の別の利点は、RTCA器具は電気インピーダンスの変化を測定することである。これは、アッセイは、細胞フェンに対する意図しない影響を与える可能性があり、外因性の薬剤で細胞を標識することなく実行することができることを意味OTYPEまたは関数。それはそれらのインビボ性質上2の反射ではない分子および表現型変化を導入することを避けるように最小限に操作を維持することが不可欠であるとの悪性腹水から誘導された原発性卵巣癌細胞を研究する場合に特に重要になります。さらに、RTCA機器の使用は、タイムラプス顕微鏡検査に関連した分析を消費する時間を回避するが、アッセイの最適化のための重要な実験のWindowsの迅速な決定を可能にするだけでなく、リアルタイムで定量的なデータの収集を可能にします。スフェロイド浸潤に対する因子の範囲の効果を比較する際の異なる要因が経時的に異なる時点で、または大幅に異なるプロファイルでその最大の効果を発揮し得るので、これは特に有用である。
このプロトコルは、変更が( 例えば 、異なるECM行列、異なる癌細胞株、または異なるターゲットセルの使用に適しているものの、そうする場合のls)、様々な実験条件は最初に最適化しなければならないことに留意することが重要である。例えば、回転楕円体侵入の研究を開始する前に、癌細胞/ CIMプレートの最適数は、ウェルまず、単層培養中の細胞数滴定のアッセイによって決定されるべきである。ウェルあたりに使用するスフェロイドの最適数は、この分析に基づいている。最初に生成するとき、例えば、現在の方法では、スフェロイドは、約3,000個の細胞をそれぞれ含む。初期の細胞数滴定が単層中の30,000細胞を分析し、侵入での検出に最適であることを示している場合には、10スフェロイドがよく、CIMプレート当たりに添加されています。共培養実験を行うときは、この結果を混乱させる可能性があるのでさらに、それは、これらの細胞は、本質的に侵襲的であるかどうかを決定するために、別々に「標的」細胞単層の挙動を研究することが重要である。実証例では、癌スフェロイドLP9細胞monolaの上にメッキされるFBSとないヤーは、化学誘引物質としてだけでなく下部に追加。並行して、LP9細胞は、それぞれの処理条件の下で、単独で培養される。
細胞スフェロイドの浸潤能を検討する場合も同様に、それは2つの動作を区別するために、同様に彼らの回遊能力を検討することも重要です(移行はしませんがすなわち侵略は、ECMバリアのタンパク質分解が必要)。これを行うには、ECM関門(ステップ3.1.1 – 3.1.3)を省略し、所定の位置に、ECM障壁と並行して分析を行っています。所望であれば、後者の「侵入」の尺度は、前者の「マイグレーション」の小節に補正することができる。細胞を、底部チャンバ内に侵入した後、それらの付着、拡散、膜の下側増殖の変化は、変化に寄与することができる:最後に、電気インピーダンスの測定値から得られた情報が、範囲が限定されていることに留意することが重要でインピーダンスREAへこみ。スフェロイド包括的に細胞挙動を評価するために、スフェロイド細胞生存率、接着、遊走、および形態の他のアッセイと組み合わせて使用するため、この方法が最も有益である。スフェロイドの形態学及び健康の定性的評価は、浸潤の定量的RTCAアッセイと並行して行うことができるように、例えば、理想的には、完全にスフェロイド中皮相互作用を理解するために、別個の共培養物はまた、標準的な位相差顕微鏡下で定期的に画像化されるべきである。任意のラベリングステップが実行される場合、それらは回転楕円体から脱凝集および非標識中皮細胞と相互作用するように、単一の癌細胞の挙動は、蛍光顕微鏡下で測定することができる。第二の細胞型と共培養するとき、蛍光癌細胞を標識するという付加的な利点は、それが癌細胞のみが細胞とECMの障壁を通って侵入したことを確認することが可能であるということである。
<p class="jove_content">要約すると、この方法では、中皮およびECM障壁の卵巣癌スフェロイド侵略のハイスループット定量分析を表しています。ウェルCIMプレートの上側または下側チャンバーへの外因性サイトカイン、成長因子、または特異的阻害剤の添加により、この方法は、中皮およびマトリックス障壁を超える侵入卵巣癌スフェロイド細胞間の相互作用を調節する因子の迅速な判定を可能にする時間。The authors have nothing to disclose.
この作品は、CASS財団科学と医学の助成金によって支えられて; (MB);オーストラリアプロジェクト無償の国民の健康と医療研究評議会(KLS、338516);とビクトリア州政府の業務インフラ支援プログラム(オーストラリア)。
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |