पेरिटोनियम के mesothelial अस्तर में डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका आक्रमण समय के साथ एक गतिशील प्रक्रिया है. एक वास्तविक समय विश्लेषक का उपयोग, एक अंडाकार आकृति-मेसोथेलियल सेल सह संस्कृति मॉडल में डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक क्षमता metastatic प्रक्रिया को विनियमित करने वाले कारकों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने, लंबे समय अवधि में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
डिम्बग्रंथि के कैंसर peritoneal तरल पदार्थ में बहा और पेरिटोनियम भीतर बाहर साइटों के लिए dispersing द्वारा metastasize. कैंसर की कोशिकाओं को स्वाभाविक करने के लिए संलग्न और माध्यमिक ट्यूमर के रूप में पेरिटोनियल अस्तर हमलावर द्वारा metastatic प्रक्रिया में योगदान जो बहुकोशिकीय संरचनाओं में कुल के रूप में monolayer संस्कृतियों सही, एक nonadherent पर्यावरण के भीतर कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार मॉडल नहीं है. डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस, बहुकोशिकीय समुच्चय, या spheroids के इस महत्वपूर्ण चरण के लिए मॉडल, nonadherent परिस्थितियों में बनाए रखा स्थापित डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों से उत्पन्न हो सकता है. Vivo में ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा सामना करना पड़ा पेरिटोनियल microenvironment नकल करने के लिए, एक अंडाकार आकृति-मेसोथेलियल सह संस्कृति मॉडल spheroids एक बाह्य मैट्रिक्स बाधा से अधिक का गठन, एक मानव mesothelial सेल monolayer के शीर्ष पर चढ़ाया जाता है preformed जो में स्थापित किया गया था. तरीके तो मात्रात्मक वास्तविक संचालन करने के लिए एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक का उपयोग कर विकसित किया गयाspheroids के रूप में विकसित विभिन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों के आक्रामक क्षमता की समय मापन. यह दृष्टिकोण पारंपरिक समापन बिंदु assays और अधिक श्रमसाध्य वास्तविक समय माइक्रोस्कोपी छवि का विश्लेषण करती है पर कई फायदे हैं, जो समय की लंबी अवधि में आक्रमण की निरंतर माप के लिए अनुमति देता है. संक्षेप में, इस विधि समय के साथ मेसोथेलियल और मैट्रिक्स बाधाओं के माध्यम से हमलावर डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल कोशिकाओं के बीच बातचीत को विनियमित जो कारकों की एक तेजी से, दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता है.
डिम्बग्रंथि के कैंसर के सभी स्त्रीरोगों कैंसर 1 के उच्चतम मृत्यु दर है. दुनिया भर में, ~ 230,000 मामलों और वजह से हर साल 1 रोग से 100,000 से अधिक लोगों की मृत्यु रहे हैं. अधिकांश रोगियों (> 75%) कैंसर पहले से ही metastasized है के बाद इलाज के आगे कीमोथेरेपी की वृद्धि हुई प्रतिरोध से जटिल है जब, निदान और रोग का निदान 2 गरीब है कर रहे हैं. चरण-III चतुर्थ metastatic रोग के साथ मरीजों को केवल 30-40% 3 से 5 साल जीवित रहने की दर है. इस प्रकार, प्रभावी रूप से उन्नत बीमारी के इलाज के क्रम में डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस अंतर्निहित सेलुलर व्यवहार का एक बेहतर समझ के लिए एक तत्काल आवश्यकता है.
डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस के मौजूदा मॉडल जो ट्यूमर व्यवहार पर प्रभाव डालता है एक अलग microenvironment में होता है, जिनमें से प्रत्येक metastatic प्रक्रिया में कई कदम का प्रस्ताव है. Metastasizing डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को शुरू में प्राथमिक ट्यूमर साइट से शेड और एक nonadher में जीवित रह रहे हैंएकल कक्षों या तीन आयामी बहुकोशिकीय संरचनाओं के रूप में peritoneal तरल पदार्थ के भीतर ईएनटी राज्य, बहुकोशिकीय समुच्चय या spheroids 2,4,5 करार दिया. निलंबन में spheroids फार्म नहीं है जो कोशिकाओं anoikis 2,4,5 लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. Spheroids भी अवशिष्ट रोग और कैंसर 2,4,5 के बाद पुनरावृत्ति के लिए योगदान, रसायन – चिकित्सा के लिए प्रतिरोध वृद्धि हुई दिखा रहे हैं. डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस में एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम पेरिटोनियल दीवार और omentum 5,6 भीतर स्थापित माध्यमिक ट्यूमर के लिए मुक्त अस्थायी समूहों से समुच्चय का संक्रमण है. सेल सेल और सेल सब्सट्रेट बातचीत कुल गठन, अस्तित्व, और पेरिटोनियम 4-11 के mesothelial अस्तर द्वारा निर्मित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के पालन में फंसाया गया है. अभी तक, इन प्रक्रियाओं खराब समझ रहे हैं.
डिम्बग्रंथि के कैंसर के प्रसार में शामिल तंत्र को परिभाषित करने के लिए, spheroids gener हो सकता हैपैदा संस्कृति मीडिया 12,13 को methylcellulose जोड़कर या कम लगाव प्लेटें 2,14 पर संवर्धन कोशिकाओं द्वारा या तो निलंबन में कोशिकाओं को बनाए रखने, nonadherent संस्कृति तरीकों का उपयोग कर स्थापित कैंसर कोशिका लाइनों से. इस तरह से सुसंस्कृत जब डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को विवो 2,14 में पाया ट्यूमर समुच्चय के समान ही है, सेलुलर आणविक, और जैव रासायनिक गुणों का प्रदर्शन जो बहुकोशिकीय समुच्चय या spheroids में इकट्ठा. गठन के बाद, spheroids बाद में nonadherent मध्यम से काटा जा सकता है और आगे कार्यात्मक अध्ययन के लिए ठोस सतहों की एक किस्म पर replated. यह सही ऐसे intraperitoneal तरल पदार्थ के रूप में एक nonadherent पर्यावरण के भीतर metastasizing डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार मॉडल नहीं है जो monolayer संस्कृति में assays पर एक अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है.
कैंसर spheroids की आक्रामक क्षमता Boyden कक्षों 2 में परंपरागत समापन बिंदु assays में मूल्यांकन किया जा सकता </suडिम्बग्रंथि के कैंसर सेल आक्रमण समय के साथ एक गतिशील प्रक्रिया है के रूप में पी>, लेकिन इस दृष्टिकोण को गुमराह किया जा सकता है. हाल ही में एक वास्तविक समय विधि डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids 15,16 हमलावर द्वारा mesothelial सेल निकासी के समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर तैयार किया गया है; बहरहाल, समय व्यतीत हो जाने के डेटा का विश्लेषण समय लगता है और व्यक्तिपरक हो सकता है. इस के साथ साथ, वास्तविक समय में डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids के आक्रामक व्यवहार का आकलन करने के लिए एक तेजी से, मात्रात्मक विधि वर्णित है. सबसे पहले, एक अंडाकार आकृति-मेसोथेलियल सेल मॉडल बहुकोशिकीय spheroids को देते हैं और माध्यमिक ट्यूमर के रूप में पेरिटोनियल अस्तर पर आक्रमण जब डिम्बग्रंथि के कैंसर मेटास्टेसिस के चरण का प्रतिनिधित्व करता है जो स्थापित किया गया था. फिर एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक (RTCA, कंपनी विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें) के लिए कार्यप्रणाली spheroids के रूप में हो गई है और इस मॉडल में परीक्षण अलग डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों के आक्रामक क्षमता की मात्रात्मक वास्तविक समय माप का संचालन करने के लिए अनुकूलित किया गया था.
RTCA में मेंstrument, सेलुलर प्रतिक्रियाओं विद्युत प्रतिबाधा में बदलाव को मापने के द्वारा, एक्सोजेनस लेबल के लिए आवश्यकता के बिना, एक परख के पाठ्यक्रम पर लगातार निगरानी कर रहे हैं. विशेष रूप से डिजाइन संस्कृति प्लेटें एक अच्छी तरह से 2 संभाग '(यूके' प्लेट) के ऊपरी और निचले कक्षों के बीच इंटरफेस में एक microporous झिल्ली के नीचे स्थित स्वर्ण लेपित microelectrodes है. कोशिकाओं को एक ईसीएम या ईसीएम / सेलुलर बाधा के माध्यम से आक्रमण के रूप में निचले सदन में इलेक्ट्रोड के स्थान विद्युत प्रतिबाधा में परिवर्तन की माप के लिए सक्षम बनाता है. प्रत्येक यूके प्लेट अच्छी तरह से 2 कक्षों के बीच झिल्ली इंटरफ़ेस सबसे पहले ब्याज की ईसीएम घटक के साथ लेपित है. अंडाकार आकृति-मेसोथेलियल सेल मॉडल प्रणाली में, इंटरफेस मानव मेसोथेलियल का एक मिला हुआ monolayer द्वारा पीछा पेरिटोनियम के mesothelial अस्तर अंतर्निहित जटिल ईसीएम की नकल करने Matrigel की एक परत (कंपनी के विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें), 'साथ लेपित है लक्ष्य 'कोशिकाओं. अंत में, पूर्व गठित डिम्बग्रंथि के कैंसर spheroids विज्ञापन कर रहे हैंded. डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल कोशिकाओं को सक्रिय रूप से नीचे कक्ष तक पहुंचने और विद्युत प्रतिबाधा रीडिंग को बदलने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं की परत और मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण करना होगा. अपने दम पर लक्ष्य कोशिकाओं भी वे मैट्रिक्स परत के माध्यम से आक्रमण और इस परख में उपयोग के लिए उपयुक्त हैं नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं.
हमलावर डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं fibroblasts, adipocytes, और mesothelial कोशिकाओं सहित पेरिटोनियम की सतह पर सेल प्रकार की एक किस्म के साथ बातचीत, और कैंसर कोशिकाओं और peritoneal कोशिकाओं के बीच द्विदिश संचार metastatic प्रक्रिया 2 ड्राइविंग में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सोचा है. एक बार जब महारत हासिल है, के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल पेरिटोनियल microenvironment के भीतर इन संबंधों के अध्ययन के लिए आसानी से अनुकूलनीय है, जैसे, एक्सोजेनस साइटोकिन्स, वृद्धि कारक है, या यूके में अच्छी तरह से थाली या आनुवंशिक हेरफेर के ऊपरी या निचले कक्षों के लिए विशिष्ट inhibitors के अलावा के माध्यम से कैंसर या पेरिटोनियल सेल लाइनों की. इसके अलावा, इस विधि विनियामक संकेत और peritoneal गुहा के भीतर एक metastatic घाव की स्थापना को नियंत्रित करने वाले सेलुलर बातचीत में प्रत्यक्ष अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए घातक जलोदर और / या प्राथमिक peritoneal कोशिकाओं से हौसले से काटा प्राथमिक डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया जा सकता है <sऊपर> 2.
एकल कक्षों या spheroids की आक्रामक क्षमता को मापने के लिए RTCA साधन का प्रयोग पारंपरिक एकल समापन बिंदु assays और समय चूक छवि का विश्लेषण करती है पर कई लाभ प्रदान करता है. RTCA साधन घंटे या दिन हो सकता है जो एक परख, के पाठ्यक्रम पर लगातार अंतराल परिभाषित सेलुलर आक्रमण के उपाय. यह एकल समापन बिंदु assays की सीमाओं पर काबू जो समय के साथ आक्रमण की दर में परिवर्तन के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, एक समापन बिंदु (चित्रा 2), उदाहरण के लिए, 3 घंटा में विभिन्न कैंसर कोशिका लाइनों से आक्रमण डेटा की जांच, केजीएन और OVCA433 कोशिकाओं कहीं अधिक आक्रामक OVCA429 कोशिकाओं की तुलना में थे कि गलत निष्कर्ष करने के लिए नेतृत्व हो सकता है. इस तकनीक का एक और लाभ RTCA साधन विद्युत प्रतिबाधा में बदलाव उपाय है. इस assays सेल Phen पर अनायास ही प्रभाव हो सकता है, जो एक exogenous एजेंट के साथ कोशिकाओं लेबलिंग के बिना चलाए जा सकता है कि इसका मतलब हैotype या समारोह. यह उनके vivo प्रकृति 2 को प्रतिबिंबित नहीं कर रहे हैं जो आणविक और प्ररूपी परिवर्तन शुरू करने से बचने के लिए एक न्यूनतम करने के लिए जोड़तोड़ रखना अनिवार्य है, जिसके साथ घातक जलोदर, से व्युत्पन्न प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं का अध्ययन करने पर यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है. इसके अलावा, RTCA साधन का उपयोग समय समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ जुड़ा विश्लेषण लेने से बचा जाता है, लेकिन यह भी परख अनुकूलन के लिए कुंजी प्रयोगात्मक खिड़कियों के तेजी से दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता है, जो न केवल वास्तविक समय में मात्रात्मक डेटा के संग्रह के लिए सक्षम बनाता है. उपगोल आक्रमण पर कारकों की एक सीमा के प्रभाव की तुलना करने पर यह विशेष रूप से उपयोगी है, के रूप में विभिन्न कारकों अलग timepoints पर या समय के साथ बहुत अलग प्रोफाइल के साथ अपने अधिक से अधिक प्रभाव डालती सकता है.
इस प्रोटोकॉल परिवर्तन (जैसे, के लिए उत्तरदायी है हालांकि अलग ईसीएम मैट्रिक्स, विभिन्न कैंसर कोशिका लाइनों, या अलग लक्ष्य सेल का उपयोगऐसा करने से अगर लोकसभा),, यह विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों पहली अनुकूलित किया जाना चाहिए कि नोट करना महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, पिछले उपगोल आक्रमण की पढ़ाई शुरू करने, कैंसर कोशिकाओं / यूके थाली के इष्टतम संख्या वैसे पहले monolayer संस्कृति में सेल नंबर titrations की परख द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. अच्छी तरह से प्रति उपयोग करने के लिए spheroids के इष्टतम संख्या तो इस विश्लेषण पर आधारित है. पहले उत्पन्न करते हैं, उदाहरण के लिए, वर्तमान विधि में, spheroids प्रत्येक लगभग 3000 कोशिकाओं शामिल. प्रारंभिक सेल नंबर titrations monolayer में 30,000 कोशिकाओं का विश्लेषण करती आक्रमण में पता लगाने के लिए इष्टतम संकेत मिलता है कि, तो 10 spheroids अच्छी तरह यूके प्लेट प्रति जोड़ रहे हैं. सह संस्कृति प्रयोगों का आयोजन इसके अलावा, जब यह अलग से इन कोशिकाओं को इस परिणाम उलझाना सकता है, जैसा कि स्वाभाविक आक्रामक रहे हैं ताकि यह निर्धारित करने में 'लक्ष्य' सेल monolayer के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. का प्रदर्शन उदाहरण में, कैंसर spheroids एक LP9 सेल monola के शीर्ष पर चढ़ाया जाता हैFBS के साथ और बिना Yer, एक chemoattractant के रूप में अच्छी तरह से नीचे तक गयी. समानांतर में, LP9 कोशिकाओं प्रत्येक उपचार शर्त के तहत अकेले सुसंस्कृत हैं.
कोशिकाओं और spheroids की आक्रामक क्षमता का अध्ययन इसी प्रकार, जब यह दो व्यवहार (माइग्रेशन नहीं करता है, जबकि यानी आक्रमण एक ईसीएम बाधा के proteolytic पाचन की आवश्यकता है) भेद करने के क्रम में उनके साथ ही प्रवासी क्षमताओं की जांच के लिए भी महत्वपूर्ण है. ऐसा करने के लिए, ईसीएम बाधा न आना (3.1.1 कदम – 3.1.3) और जगह में ईसीएम बाधा के साथ समानांतर में परख आचरण. अगर वांछित उत्तरार्द्ध 'आक्रमण' उपाय, पूर्व 'माइग्रेशन' उपाय करने के लिए सही किया जा सकता है. कोशिकाओं नीचे चेंबर में हमला किया है एक बार, उनके लगाव, प्रसार, और झिल्ली के नीचे पर प्रसार में परिवर्तन में परिवर्तन करने के लिए योगदान कर सकते हैं: अंत में, यह विद्युत प्रतिबाधा के उपायों से प्राप्त जानकारी के दायरे में सीमित है कि नोट करना महत्वपूर्ण है प्रतिबाधा वजहdings. व्यापक अंडाकार आकृति सेल व्यवहार का आकलन करने के क्रम में अंडाकार आकृति सेल व्यवहार्यता, आसंजन, प्रवास, और आकृति विज्ञान की अन्य assays के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल करते हैं, इसलिए, इस पद्धति सबसे जानकारीपूर्ण है. अंडाकार आकृति आकृति विज्ञान और स्वास्थ्य के गुणात्मक आकलन आक्रमण की मात्रात्मक RTCA assays के साथ समानांतर में किया जा सकता है, ताकि उदाहरण के लिए, आदर्श रूप में, पूरी तरह से अंडाकार आकृति-मेसोथेलियल बातचीत को समझने के क्रम में, अलग सह संस्कृतियों भी मानक चरण माइक्रोस्कोपी के तहत समय समय पर imaged किया जाना चाहिए. वैकल्पिक लेबलिंग कदम किया जाता है तो वे अंडाकार आकृति से disaggregate और unlabeled mesothelial कोशिकाओं के साथ बातचीत के रूप में, फिर भी कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत निर्धारित किया जा सकता है. एक दूसरा सेल प्रकार के साथ सह संवर्धन जब fluorescently कैंसर कोशिकाओं लेबलिंग का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह केवल कैंसर कोशिकाओं सेल और ईसीएम बाधाओं के माध्यम से आक्रमण किया है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए तो संभव है कि है.
<p class="jove_content"> संक्षेप में, इस विधि मेसोथेलियल और ईसीएम बाधाओं का डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल आक्रमण का एक उच्च throughput मात्रात्मक विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करता है. बहिर्जात साइटोकिन्स, वृद्धि कारक है, या अच्छी तरह से यूके थाली के ऊपरी या निचले कक्षों के लिए विशिष्ट inhibitors के अलावा के माध्यम से, इस विधि से अधिक मेसोथेलियल और मैट्रिक्स बाधाओं के माध्यम से हमलावर डिम्बग्रंथि के कैंसर उपगोल कोशिकाओं के बीच बातचीत को विनियमित जो कारकों की एक तेजी से, दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता है समय.The authors have nothing to disclose.
यह काम एक CASS फाउंडेशन विज्ञान और चिकित्सा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; (एमबी); ऑस्ट्रेलिया परियोजना अनुदान की एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (KLS, 338516); और विक्टोरियन सरकार का परिचालन बुनियादी सुविधाओं सहायता कार्यक्रम (ऑस्ट्रेलिया) से.
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |