Invasão de células do cancro do ovário no revestimento mesotelial do peritoneu é um processo dinâmico ao longo do tempo. Utilizando um analisador de tempo real, a capacidade invasiva das células de câncer de ovário em uma célula modelo de co-cultura esferóide-mesoteliais podem ser quantificados durante períodos de tempo prolongados, fornecendo insights sobre os fatores que regulam o processo metastático.
Cancros do ovário metástase derramando no líquido peritoneal e dispersando aos locais distais dentro do peritônio. Culturas em monocamada não modelar de forma precisa o comportamento de células cancerosas no interior de um ambiente não-aderente, tal como as células cancerosas agregar inerentemente em estruturas multicelulares que contribuem para o processo metastático por anexação e invadir o revestimento peritoneal para formar tumores secundários. Para modelar esta importante etapa da metástase do cancro do ovário, os agregados multicelulares, ou esferóides, podem ser gerados a partir de linhagens de células de câncer de ovário estabelecidos mantidos em condições não-aderentes. Para simular o microambiente peritoneal encontrado por células de tumor in vivo, num modelo de co-cultura esferóide-mesotelial foi estabelecido em que pré-formado esferóides são colocadas no topo de uma monocamada de células de mesotélio humano, formado ao longo de uma barreira de matriz extracelular. Métodos foram então desenvolvidos utilizando um analisador de células em tempo real para conduzir verdadeiro quantitativaAs medições do tempo da capacidade invasiva de diferentes linhas de células de cancro do ovário, desenvolvidos como esferóides. Esta abordagem permite a medição contínua da invasão por longos períodos de tempo, o que tem várias vantagens sobre os ensaios de ponto final tradicionais e análises em tempo real da imagem de microscopia mais laborioso. Em suma, este método permite uma rápida, a determinação de fatores que regulam as interações entre células de câncer de ovário esferóides invasores através mesoteliais e matriz barreiras ao longo do tempo.
O câncer de ovário tem a maior taxa de mortalidade de todos os cânceres ginecológicos 1. No mundo, há ~ 230.000 casos e mais de 100.000 mortes em decorrência da doença a cada ano 1. (> 75%) A maioria dos pacientes são diagnosticados depois que o câncer já tem metástase, quando o tratamento é ainda mais complicada pelo aumento da resistência à quimioterapia eo prognóstico é pobre 2. Pacientes com estadio III-IV doença metastática têm taxas de sobrevida em 5 anos de apenas 30-40% 3. Assim, existe uma necessidade urgente para uma melhor compreensão dos comportamentos celulares subjacentes a metástase do cancro de ovário, a fim de tratar eficazmente a doença avançada.
O atual modelo de metástase do câncer de ovário propõe várias etapas no processo metastático, cada uma das quais ocorre em um microambiente distinta que impactos no comportamento do tumor. Metástase de células de câncer de ovário, inicialmente, são derramadas a partir do local do tumor primário e sobreviver em um nonadherestado ent dentro do fluido peritoneal como células individuais ou estruturas multicelulares tridimensionais, denominado agregados multicelulares ou esferóides 2,4,5. As células que não fazem esferóides em suspensão são mais suscetíveis a anoikis 2,4,5. Spheroids também apresentam maior resistência a quimioterápicos, contribuindo para a doença residual e recorrência posterior da 2,4,5 câncer. Um segundo passo crítico na metástase do câncer de ovário é a transição de agregados a partir de aglomerados de livre flutuação de tumores secundários estabelecidos dentro da parede peritoneal e omento 5,6. Interacções célula-célula e célula-substrato foram implicados na formação de agregados, a sobrevivência e a adesão à matriz extracelular (ECM) produzida pelo revestimento mesotelial do peritoneu 4-11. Até ao momento, estes processos não são bem entendidos.
Para definir os mecanismos envolvidos na disseminação dos cânceres de ovário, esferóides podem ser generated a partir de linhas celulares de cancro estabelecidas utilizando métodos de cultura de não-aderentes, a manutenção de células em suspensão, quer por adição de metilcelulose a meio de cultura 12,13 ou por cultura de células em placas de menor fixação 2,14. Quando cultivadas desta maneira, as células de cancro do ovário montar em agregados multicelulares ou esferóides, que exibem propriedades celulares, moleculares e bioquímicas semelhantes às de agregados tumorais encontradas in vivo 2,14. Após a formação, esferóides pode ser subsequentemente recolhido do meio não-aderentes e replaqueadas para uma variedade de superfícies sólidas para estudos funcionais. Isto representa um avanço sobre os ensaios em cultura em monocamada, que não modelar de forma precisa o comportamento de células de cancro do ovário metastizados dentro de um ambiente não-aderentes, tais como o fluido intraperitoneal.
A capacidade invasiva de esferóides de câncer pode ser avaliado em ensaios de terminais tradicionais em câmaras de Boyden 2 </sup>, mas esta abordagem pode ser enganadora, como a invasão de células do cancro do ovário é um processo dinâmico ao longo do tempo. Um método em tempo real recente foi concebido através de microscopia de vídeo time-lapse de folga células mesoteliais invadindo esferóides de câncer de ovário 15,16; No entanto, a análise de dados de intervalo de tempo é demorada e pode ser subjectiva. Aqui, um método rápido, quantitativo para avaliar os comportamentos invasivos de esferóides de câncer de ovário em tempo real é descrito. Em primeiro lugar, um modelo de célula esferóide-mesoteliais foi estabelecido que representa o estágio da metástase do câncer de ovário quando esferóides multicelulares juntar-se e invadir o revestimento peritoneal para formar tumores secundários. Em seguida, a metodologia para um analisador de tempo real celular (RTCA, ver a tabela de Materiais para detalhes da empresa) foi adaptado para realizar medições em tempo real quantitativos da capacidade invasiva de diferentes linhas de células de cancro do ovário, desenvolvidos como esferóides e testados neste modelo.
No RTCA emtrumento, as respostas celulares são monitorados continuamente ao longo do curso de um ensaio, sem a necessidade de etiquetas exógenos, medindo as alterações na impedância eléctrica. As placas de cultura especialmente concebidos para ter microeléctrodos revestido de ouro localizado debaixo de uma membrana microporosa na interface entre as câmaras superior e inferior de um 2 câmaras poço (placas "CIM"). A localização dos eletrodos na Câmara permite a medição das mudanças na impedância elétrica como células invadir através de um ECM ou ECM / barreira celular. A interface da membrana entre as duas câmaras de cada poço de placa CIM é primeiramente revestida com o componente de interesse de ECM. No sistema modelo de célula-esferóide mesotelial, a interface é revestido com uma camada de Matrigel (veja a tabela de Materiais para detalhes da empresa), para imitar o ECM complexo subjacente ao revestimento mesotelial do peritoneu, seguido de uma monocamada confluente de mesotélio humano ' das células-alvo. Finalmente, pré-formados esferóides de câncer de ovário são added. Células esferóides câncer de ovário devem invadir ativamente através da camada de células-alvo e matriz para alcançar a câmara inferior e alterar as leituras de impedância elétrica. As células alvo na sua própria também são avaliados para garantir que eles não invadem através da camada de matriz e são adequados para utilização neste ensaio.
Que invadem as células de cancro do ovário interagir com uma variedade de tipos de células na superfície do peritoneu, incluindo fibroblastos, adipócitos e células mesoteliais, e a comunicação bidireccional entre as células cancerosas e as células peritoneais é pensada para desempenhar um papel-chave na condução do processo metastático 2. Uma vez dominado, o protocolo aqui descrito é facilmente adaptável para o estudo destas interacções dentro do microambiente peritoneal, por exemplo, através da adição de citocinas exógenas, factores de crescimento, ou inibidores específicos para as câmaras superiores e inferiores da placa de CIM bem ou manipulação genética do cancro ou de linhas de células peritoneais. Além disso, este método pode ser usado com as células do tumor dos ovários primários colhidos de fresco a partir de ascite maligna e / ou células peritoneais primárias para obter insights directas para os sinais de regulação e das interacções celulares que governam a criação de uma lesão metastática no interior da cavidade peritoneal <sup> 2.
A utilização do instrumento RTCA para medir a capacidade invasiva de células individuais ou esferóides oferece várias vantagens sobre os ensaios de terminais individuais convencionais e analisa imagem time-lapse. O instrumento mede RTCA invasão celular em intervalos definidos de forma contínua durante o curso de um ensaio, o qual pode demorar horas ou dias. Isso permite a determinação de mudanças na taxa de invasão ao longo do tempo, o que supera as limitações dos ensaios de terminais individuais. Por exemplo, analisando os dados de invasão das linhas celulares de cancro diferentes em um único ponto de extremidade (Figura 2), por exemplo, 3 horas, pode ter levado à conclusão errônea de que KGN e OVCA433 células eram muito mais invasivo do que OVCA429 células. Outra vantagem desta tecnologia é que o instrumento RTCA mede mudanças na impedância elétrica. Isto significa que os ensaios podem ser executados sem marcação das células com um agente exógeno, o que poderia ter repercussões indesejadas sobre phen celularotype ou função. Isto torna-se particularmente importante quando se estuda as células de câncer de ovário primários derivados da ascite maligna, com o qual é imperativo manter manipulações ao mínimo, de modo a evitar a introdução de alterações moleculares e fenotípicos que não são o reflexo de sua natureza in vivo 2. Além disso, a utilização do aparelho RTCA permite a recolha de dados quantitativos em tempo real, o que não só evite o demorado análises associados com microscopia de lapso de tempo, mas também permite a determinação rápida de janelas experimentais fundamentais para a optimização do ensaio. Isto é particularmente útil quando se comparam os efeitos de uma gama de factores de invasão esferóide, dado que vários factores podem exercer os seus efeitos máximos em momentos diferentes, ou com diferentes perfis muito mais tempo.
Embora este protocolo é passível de alterações (por exemplo, uso de diferentes matriz ECM, linhas celulares de cancro diferentes, ou diferente cel alvosl), se fazer isso, é importante notar que as várias condições experimentais devem primeiro ser optimizado. Por exemplo, antes de se iniciar os estudos de invasão esferóide, o número óptimo de células cancerosas / placa CIM bem, em primeiro lugar deve ser determinado por ensaio de titulação número de células em cultura em monocamada. O número óptimo de esferóides de usar por poço é então com base nessa análise. Por exemplo, no método actual, esferóides compreendem aproximadamente 3.000 células quando cada primeiro gerado. Se titulações número de células iniciais indicam que 30.000 células em monocamada são ideais para a detecção de invasão analisa, em seguida, 10 esferóides são adicionados por placa CIM bem. Além disso, quando a realização de experiências de co-cultura, é importante para estudar o comportamento do "alvo" monocamada de células em separado, a fim de determinar se estas células são inerentemente invasivo, uma vez que pode confundir os resultados. No exemplo demonstrado, esferóides de cancro foram semeadas em cima de uma célula monola LP9yer, com e sem FBS adicionada à parte inferior bem como uma chemoattractant. Em paralelo, as células são cultivadas LP9 sozinho, em cada condição de tratamento.
Da mesma forma, quando se estuda a capacidade invasiva de células e esferóides, também é importante examinar as suas capacidades migratórias bem, a fim de distinguir as duas condutas (ou seja, invasão requer a digestão proteolítica de uma barreira de ECM enquanto migração não). Para fazer isso, omitir a barreira ECM (Passos 3.1.1 – 3.1.3) e realizar o ensaio em paralelo com a barreira de ECM no lugar. A última medida "invasão" pode ser corrigido à antiga medida "migração", se desejar. Finalmente, é importante observar que a informação obtida a partir de medidas de impedância eléctrica está limitado no seu âmbito: uma vez que as células tenham invadido para dentro da câmara inferior, as mudanças na sua fixação, espalhamento, e proliferação sobre o lado inferior da membrana pode contribuir para mudanças nas impedância readings. Assim, este método é mais informativa quando usado em conjunto com outros testes de viabilidade de células esferóide, adesão, migração, e morfologia, a fim de avaliar exaustivamente comportamentos celulares esferóides. Por exemplo, o ideal, a fim de compreender as interações esferóides-mesotélio, co-culturas separadas também deve ser trabalhada periodicamente sob microscopia de fase padrão, de modo que as avaliações qualitativas da morfologia esferóide e saúde podem ser feitas em paralelo com os ensaios RTCA quantitativas de invasão. Se a etapa de rotulagem facultativa é realizada, em seguida, os comportamentos das células cancerosas individuais podem ser determinado por microscopia de fluorescência como desagregar do esferóide e interagir com as células mesoteliais sem rótulos. Um benefício adicional de fluorescência marcação das células cancerosas, quando a co-cultura com um segundo tipo de célula que é, em seguida, é possível constatar que apenas as células cancerosas invadiram através das barreiras celulares e de ECM.
<p class="jove_content"> Em resumo, este método representa um débito análise quantitativa alta de invasão esferóide câncer de ovário de barreiras mesoteliais e ECM. Através da adição de citocinas exógenas, fatores de crescimento, ou inibidores específicos para as câmaras superiores ou inferiores da placa CIM bem, este método permite uma rápida, a determinação de fatores que regulam as interações entre células de câncer de ovário esferóides invasores através de mesotélio e barreiras ao longo da matriz tempo.The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por uma CASS Fundação Ciência e Medicina Grant; (MB); um Conselho de Pesquisa Nacional de Saúde e Medicina da Austrália Projeto Grant (KLS, 338516); e pelo Programa de Apoio à Infra-Estrutura Operacional do Governo de Victoria (Austrália).
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |