Ovarian cancer cell invasion in mesothelial slemhinnan i peritoneum är en dynamisk process med tiden. Med hjälp av en realtid analysator, kan den invasiva kapacitet av äggstockscancerceller i en sfäroid-mesotelcell co-kultur-modellen kvantifieras under långa tidsperioder, som ger inblick i faktorer som reglerar metastaserande process.
Äggstockscancer metastaser genom att kasta in i peritonealvätska och dispergering till distala platser inom bukhinnan. Monolager kulturer inte exakt modell beteenden av cancerceller i en nonadherent miljö, som cancerceller i sig aggregera in flercelliga strukturer som bidrar till den metastatiska processen genom att fästa till och invadera peritoneal foder för att bilda sekundära tumörer. För att modellera detta viktiga skede av äggstockscancer metastaser, flercelliga aggregat, eller sfäroider, kan genereras från etablerade äggstockscancercellinjer som upprätthålls i enlighet med icke-vidhäftande förhållanden. För att efterlikna den peritoneala microenvironmenten påträffas av tumörceller in vivo genomfördes en sfäroid-mesothelial samodling modell upprättas där förformade sfäroider stryks ut på toppen av en mänsklig mesotelcell monoskiktet, bildat över en extracellulär matrisbarriär. Metoder har sedan utvecklats med hjälp av en realtidscell analysator för att genomföra kvantitativa realtidsmätningar av den invasiva kapacitet av olika äggstockscancercellinjer som odlats som sfäroider. Detta tillvägagångssätt möjliggör kontinuerlig mätning av invasion under långa perioder, vilket har flera fördelar jämfört med traditionella endpoint analyser och mer arbetskrävande realtids mikroskopi bildanalyser. Kort sagt, gör denna metod en snabb, fastställande av faktorer som reglerar samspelet mellan äggstockscancer sfäroida celler invaderar genom mesotel och matrisbarriärer över tid.
Äggstockscancer är den högsta dödligheten av alla gynekologiska cancerformer 1. I hela världen finns det ~ 230.000 fall och över 100.000 dödsfall till följd av sjukdomen varje år 1. De flesta patienter (> 75%) diagnostiseras när cancern redan har metastaserat, när behandlingen kompliceras ytterligare av ökad resistens mot kemoterapi och prognosen är dålig 2. Patienter med stadium III-IV metastaserad sjukdom har 5 årsöverlevnaden för endast 30-40% 3. Således finns det ett akut behov av en bättre förståelse av de cellulära beteenden som ligger bakom äggstockscancer metastaser för att effektivt behandla avancerad sjukdom.
Den nuvarande modellen för äggstockscancer metastaser föreslår flera steg i metastaserande process, som var och en förekommer i en särskild mikromiljö vilket påverkar tumörbeteende. Metastaserande äggstockscancer celler initialt fälls från den primära tumören platsen och överleva i en nonadherent tillstånd i peritonealvätska som enskilda celler eller tredimensionella flercelliga strukturer, benämnd flercelliga aggregat eller sfäroider 2,4,5. Celler som inte utgör spheroids i suspension är mer mottagliga för anoikis 2,4,5. Spheroids uppvisar också ökad resistens mot kemoterapeutika, bidrar till kvarvarande sjukdom och efterföljande återfall av cancern 2,4,5. Ett andra viktigt steg i äggstockscancer metastaser är övergången av aggregat från fritt flytande kluster till etablerade sekundära tumörer inom peritoneal väggen och omentum 5,6. Cell-cell och cell-substrat interaktioner har varit inblandade i aggregatbildning, överlevnad och anslutning till den extracellulära matrisen (ECM) som produceras av mesothelial slemhinnan i bukhinnan 4-11. Än så länge är dessa processer dåligt kända.
För att definiera de mekanismer som är involverade i spridningen av äggstockscancer, kan spheroids vara geneated från etablerade cancercellinjer med användning av icke-adherenta kulturmetoder, bibehålla celler i suspension antingen genom tillsats av metylcellulosa till odlingsmediet 12,13 eller genom att odla celler på låga fastsättningsplattoma 2,14. När de odlas på detta sätt, ovarian cancerceller montera in multicellulära aggregat eller sfäroider, vilka uppvisar liknande cellulära, molekylära och biokemiska egenskaper som motsvarar dem hos tumöraggregat påträffats in vivo 2,14. Efter bildandet kan spheroids därefter skördas från nonadherent medium och replated på en mängd olika fasta ytor för ytterligare funktionella studier. Detta utgör ett framsteg jämfört med analyser i monolager kultur, som inte exakt modell beteenden av äggstockscancerceller metastaserande inom en icke vidhäftande miljö såsom intraperitoneal vätska.
Den invasiva kapacitet av cancer spheroids kan bedömas i traditionella endpoint analyser i Boyden kammare 2 </sup>, men detta tillvägagångssätt kan vara missvisande, eftersom äggstockscancer cellinvasion är en dynamisk process över tid. En nyligen realtid metod har tagits fram med hjälp av time-lapse video mikroskopi av mesotelcell clearance av invaderande äggstockscancer sfäroider 15,16; Men, är analys av tid förfaller uppgifter tidskrävande och kan vara subjektiv. Häri är en snabb, kvantitativ metod för att bedöma de invasiva beteenden av äggstockscancer sfäroider i realtid beskrivs. För det första var en sfäroid-mesotelcell modell form som utgör det skede av äggstockscancer metastaser när flercelliga sfäroider fäster och invaderar peritoneal foder för att bilda sekundära tumörer. Sedan metodik för en Real Time Cell Analyzer (RTCA, se Material tabellen för företagsinformation) anpassades för att genomföra kvantitativa realtid mätningar av invasiva kapacitet olika äggstockscancercellinjer som odlats som sfäroider och testade i denna modell.
I RTCA imentet, är cellulära svar övervakas kontinuerligt under loppet av en analys, utan behov av exogena etiketter, genom att mäta förändringar i elektriska impedansen. Speciellt utformade odlingsplattor har guldbelagda mikroelektroder placerade under ett mikroporöst membran i gränssnittet mellan den övre och nedre kammare i en 2 chambered väl ("CIM-plattor). Placeringen av elektroderna i den undre kammaren möjliggör mätning av förändringar i elektrisk impedans som celler invaderar via en ECM eller ECM / cellbarriären. Membranet gränssnittet mellan de två kamrarna i varje CIM platta väl är först belagd med ECM-komponenten av intresse. I sfäroid-mesotelcell modellsystem är gränssnittet belagd med ett lager av Matrigel (se Material tabell för företagsinformation), för att efterlikna komplexa ECM underliggande mesothelial slemhinnan i bukhinnan, följt av ett sammanflytande monoskikt av humana mesotelceller ' mål-celler. Slutligen förformad äggstockscancer sfäroiderna är added. Äggstockscancer sfäroida celler måste aktivt invadera genom målceller lagret och matris för att nå den nedre kammaren och förändra elektriska impedans avläsningar. Målceller som sådana bedöms också att säkerställa att de inte invadera genom matrisskiktet och är lämpliga för användning i denna analys.
Invaderande äggstockscancerceller samverkar med en rad olika celltyper vid ytan av bukhinnan, inklusive fibroblaster, adipocyter och mesotelcellerna, och dubbelriktad kommunikation mellan cancerceller och peritonealceller tros spela viktiga roller i att driva den metastaser process 2. När behärskar, är lätt att anpassa till studiet av dessa interaktioner inom peritoneal mikro det protokoll som beskrivs häri, t.ex. genom tillsättning av exogena cytokiner, tillväxtfaktorer, eller specifika inhibitorer till den övre eller nedre kamrarna i CIM plattan väl eller genmanipulation av cancer eller peritoneala cellinjer. Dessutom kan denna metod användas med primära äggstockstumörceller skördade nyligen från malign ascites och / eller primära peritonealceller att få direkt inblick i de regulatoriska signaler och cellulära interaktioner som styr etableringen av en metastatisk lesion i bukhålan <supp> 2.
Användning av RTCA instrument för att mäta den invasiva kapacitet av enstaka celler eller sfäroider erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella enkelslutpunktsanalyser och tidsförlopp bildanalyser. Den RTCA Instrumentet mäter cellulär invasion vid definierade intervall kontinuerligt under loppet av en analys, som kan vara timmar eller dagar. Detta möjliggör bestämning av förändringar i graden av invasionen över tiden, som övervinner de begränsningar av enskilda endpoint analyser. Till exempel undersöker invasionen data från de olika cancercellinjer vid ett enda endpoint (figur 2), till exempel, 3 timmar, kan ha lett till den felaktiga slutsatsen att KGN och OVCA433 celler var långt mer invasiv än OVCA429 celler. En annan fördel med denna teknik är att den RTCA instrumentet mäter förändringar i elektrisk impedans. Det innebär att analyser kan köras utan att märka celler med en exogen agent, vilket kan få oönskade effekter på cell Phenotype eller funktion. Detta blir särskilt viktigt när man studerar primära äggstockscancerceller som härrör från malign ascites, med vilka det är viktigt att hålla manipulationer till ett minimum för att undvika att införa molekylära och fenotypiska förändringar som inte är reflekterande av sin in vivo art 2. Vidare användning av RTCA instrument möjliggör insamling av kvantitativa data i realtid, som inte bara undviker tidskrävande analyser i samband med time-lapse mikroskopi men även möjliggör snabb bestämning av viktiga experimentella fönster för analysoptimering. Detta är särskilt användbart när man jämför effekterna av en rad faktorer på sfäroid invasionen, kan så olika faktorer utövar sin maximala effekter vid olika tidpunkter eller med mycket olika profiler över tiden.
Även om detta protokoll är mottaglig för förändringar (t.ex. användning av olika ECM matris, olika cancercellinjer, eller olika mål cells), om att göra så, är det viktigt att notera att olika experimentella betingelser först måste optimeras. Till exempel, innan du påbörjar studier av sfäroid invasionen, det optimala antalet cancerceller / CIM platta väl bör först fastställas genom analys av cellnummer titreringar i monolager kultur. Det optimala antalet sfäroider att använda per brunn är då baserat på denna analys. Till exempel i den nuvarande metoden, spheroids omfatta cirka 3.000 celler vardera när först genereras. Om initiala cellnummer titreringar visar att 30.000 celler i monolager är optimala för detektion i invasionen analyser, då 10 spheroids läggs per CIM platta väl. Dessutom, när de gör co-kultur experiment, är det viktigt att studera beteenden i "mål" cell monolager för sig, för att avgöra om dessa celler är till sin natur invasiv, eftersom det kan förbrylla resultaten. I exemplet visat är cancer sfäroider pläteras ovanpå en LP9 cell Monolayer, med och utan FBS sattes till botten samt en chemoattractant. Parallellt LP9 celler odlas ensam, under varje behandlingstillstånd.
På samma sätt, när man studerar den invasiva kapacitet av celler och sfäroider, är det också viktigt att undersöka sina flytt kapacitet samt för att skilja de två beteenden (dvs. invasion kräver den proteolytiska nedbrytningen av en ECM barriär medan migration inte). För att göra detta, utelämna ECM barriären (steg 3.1.1 – 3.1.3) och genomföra analysen parallellt med ECM barriären på plats. Den senare "invasion" åtgärd kan korrigeras honom "migration" åtgärd, om så önskas. Slutligen är det viktigt att notera att den information de fått från åtgärder av elektrisk impedans är begränsad: en gång celler har invaderat in i den nedre kammaren, kan förändringar i sin infästning, spridning, och spridning på undersidan av membranet bidra till förändringar i impedans reaDings. Därför är denna metod mest informativa när den används tillsammans med andra analyser av sfäroid cellviabilitet, adhesion, migration, och morfologi för att på ett heltäckande bedömning sfäroida cell beteenden. Till exempel, i bästa fall, att till fullo förstå sfäroida-mesothelial interaktioner, separata samkulturer bör också avbildas med jämna mellanrum vid standard fasmikroskopi så att kvalitativa bedömningar av sfäroid morfologi och hälsa kan göras parallellt med kvantitativa RTCA analyser av invasion. Om steget valfria märkningen utförs, då de beteenden av enskilda cancerceller kan bestämmas under fluorescensmikroskopi som de frigöras från sfäroid och interagera med de omärkta mesotelcellerna. En extra fördel med fluorescent märkning av cancerceller när samodling med en andra celltyp är att det då är möjligt att bekräfta att endast de cancerceller har invaderat genom cell-och ECM-barriärer.
<p class="jove_content"> Sammanfattningsvis innebär denna metod en hög genomströmning kvantitativ analys av äggstockscancer sfäroid invasionen av mesothelial och ECM barriärer. Genom tillägget av exogena cytokiner, tillväxtfaktorer, eller specifika inhibitorer till den övre eller nedre kamrarna i CIM plattan väl tillåter denna metod en snabb, fastställande av faktorer som reglerar samspelet mellan äggstockscancer sfäroida celler invaderar genom mesothelial och matrisbarriärer över tid.The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en CASS Foundation Science and Medicine Grant; (MB); en National Health & Medical Research Council of Australia Project Grant (KLS, 338.516); och av den viktorianska regeringens Operational Infrastruktur Support Program (Australien).
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |