L'invasion des cellules de cancer ovarien dans la garniture de mésothéliales du péritoine est un processus dynamique dans le temps. Utilisant un véritable analyseur de temps, la capacité d'invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire dans un modèle sphéroïde mésothélial co-culture de cellules peut être quantifié sur des périodes de temps prolongées, apportant des éclairages sur les facteurs régissant le processus métastatique.
Cancers de l'ovaire métastasent en versant dans le liquide péritonéal et la dispersion des sites distaux dans le péritoine. Des cultures monocouches ne modélisent pas avec précision le comportement des cellules cancéreuses au sein d'un environnement non adhérentes, comme les cellules cancéreuses se rassemblent en soi dans les structures multicellulaires qui contribuent au processus métastatique et en attachant à envahir le péritoine pour former des tumeurs secondaires. Pour modéliser cette étape importante de métastases de cancer ovarien, agrégats multicellulaires, ou sphéroïdes, peut être généré à partir de lignées de cellules de cancer de l'ovaire établis maintenus dans des conditions non-adhérentes. Pour imiter le micro-péritonéale rencontrée par les cellules tumorales in vivo, un modèle de co-culture sphéroïde-mésothéliales a été créé en sphéroïdes préformés qui sont plaquées sur le dessus d'une monocouche de cellules mésothéliales humaines, formée par-dessus une barrière de matrice extracellulaire. Méthodes ont ensuite été développées en utilisant un analyseur de cellules en temps réel pour effectuer réel quantitativeLes mesures de temps de la capacité d'invasion des différentes lignées de cellules de cancer ovarien cultivées sous forme de sphéroïdes. Cette approche permet la mesure en continu de l'invasion sur de longues périodes de temps, ce qui présente plusieurs avantages sur les dosages de point final traditionnels et des analyses d'image plus laborieuse réel de microscopie temps. En bref, cette méthode permet une rapide, la détermination des facteurs qui régissent les interactions entre les cellules sphéroïdes de cancer ovarien invasion par mésothéliales et matrice des obstacles au fil du temps.
Cancer de l'ovaire a le taux de mortalité le plus élevé de tous les cancers gynécologiques 1. Dans le monde, il ya ~ 230 000 cas et plus de 100 000 décès dus à la maladie chaque année 1. La plupart des patients (> 75%) sont diagnostiqués après le cancer a déjà métastasé, lorsque le traitement est encore compliquée par l'augmentation de la résistance à la chimiothérapie et le pronostic est médiocre 2. Les patients de stade III-IV maladie métastatique ont des taux de survie à 5 ans de seulement 30-40% 3. Ainsi, il ya un besoin urgent d'une meilleure compréhension des comportements cellulaires qui sous-tendent les métastases du cancer de l'ovaire afin de traiter efficacement la maladie avancée.
Le modèle actuel de la métastase de cancer de l'ovaire propose plusieurs étapes du processus métastatique, dont chacune a lieu dans un micro-environnement distinct qui a une incidence sur le comportement de la tumeur. Métastases de cellules cancéreuses de l'ovaire initialement tombent à partir du site de la tumeur primaire et de survivre dans un nonadherEtat ent au sein du liquide péritonéal forme de cellules isolées ou de structures multicellulaires tridimensionnels, dite agrégats ou des sphéroïdes multicellulaires 2,4,5. Les cellules qui ne forment pas des sphéroïdes en suspension sont plus sensibles à anoikis 2,4,5. Sphéroïdes présentent également une résistance à des agents chimiothérapeutiques ont augmenté, contribuant à la maladie résiduelle et la récurrence subséquente de la 2,4,5 de cancer. Une deuxième étape critique dans la métastase de cancer de l'ovaire est la transition d'agrégats de clusters libres flottant à des tumeurs secondaires établis dans la paroi péritonéale et épiploon 5,6. Interactions cellule-cellule et cellule-substrat ont été impliqués dans la formation d'agrégats, la survie et l'adhésion à la matrice extracellulaire (MEC) produite par la muqueuse mésothéliales du péritoine 4-11. Pour l'instant, ces processus sont encore mal compris.
Pour définir les mécanismes impliqués dans la diffusion des cancers de l'ovaire, sphéroïdes peuvent être généralementATED à partir de lignées de cellules cancéreuses établies à l'aide de méthodes de culture non adhérentes, le maintien de cellules en suspension, soit en ajoutant de la méthylcellulose à des milieux de culture 12,13 ou par culture de cellules sur des plaques de fixation à faible 2,14. Lorsque cultivées de cette manière, les cellules de cancer ovarien s'assemblent en agrégats multicellulaires ou de sphéroïdes qui présentent des propriétés cellulaires, moléculaires, biochimiques et similaires à ceux des agrégats de la tumeur in vivo trouvé 2,14. Après formation, les sphéroïdes peuvent être ensuite récoltés à partir du milieu non adhérent et à nouveau ensemencées sur une variété de surfaces solides pour des études fonctionnelles. Ceci représente un progrès par rapport à des dosages en culture monocouche, qui ne sont pas de modéliser avec précision le comportement des cellules de cancer ovarien métastases au sein d'un environnement non-adhérent tel que le fluide par voie intrapéritonéale.
La capacité d'invasion des sphéroïdes de cancer peut être évaluée dans des essais finaux traditionnels dans Boyden chambres 2 </sup>, mais cette approche peut être trompeur, comme l'invasion des cellules de cancer de l'ovaire est un processus dynamique au fil du temps. Une méthode en temps réel récente a été conçu en utilisant time-lapse vidéo-microscopie de la clairance de cellules mésothéliales en envahissant sphéroïdes de cancer de l'ovaire 15,16; Cependant, l'analyse des données laps de temps prend du temps et peut être subjective. Ici, un procédé rapide, quantitatif pour évaluer les comportements invasifs de sphéroïdes de cancer ovarien en temps réel est décrit. Tout d'abord, un modèle de cellules mésothéliales-ellipsoïde a été établi, qui représente la phase de la métastase de cancer de l'ovaire lors de sphéroïdes multicellulaires fixent à et envahissent le péritoine pour former des tumeurs secondaires. Ensuite, la méthodologie pour un analyseur en temps réel portable (RTCA, voir le tableau des matériaux pour les détails de la société) a été adapté pour mener de véritables mesures quantitatives de temps de la capacité invasive de différentes lignées cellulaires de cancer de l'ovaire cultivées sous forme de sphéroïdes et testées dans ce modèle.
Dans le RTCAinstrument, les réponses cellulaires sont contrôlées en permanence au cours d'un dosage, sans la nécessité d'étiquettes exogènes, en mesurant les variations de l'impédance électrique. Des plaques de culture spécialement conçus ont microélectrodes d'or revêtues situées en dessous d'une membrane microporeuse à l'interface entre les chambres supérieure et inférieure d'un puits 2 chambrés (plaques "ICM"). L'emplacement des électrodes dans la chambre inférieure permet de mesurer des variations de l'impédance électrique en tant que cellules envahissent à travers un ou ECM ECM / barrière cellulaire. L'interface de la membrane entre les deux chambres de chaque plaque ainsi CIM est tout d'abord revêtu avec le composant ECM d'intérêt. Dans le système de modèle de cellule sphéroïde-mésothéliales, l'interface est revêtue d'une couche de Matrigel (voir la table des matières pour les détails de l'entreprise), de mimer l'ECM complexe qui sous-tend la doublure mésothéliales du péritoine, suivie d'une monocouche confluente de mésothéliales humaines ' «cellules cibles. Enfin, sphéroïdes de cancer de l'ovaire préformés sont added. Les cellules de cancer ovarien sphéroïdes doivent envahir activement à travers la couche de cellules cibles et de la matrice pour accéder à la chambre inférieure et de modifier les lectures d'impédance électrique. Les cellules cibles sur leurs propres sont également évalués pour s'assurer qu'ils ne sont pas envahir à travers la couche de matrice et peuvent être utilisés dans ce dosage.
Invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire interagissent avec une variété de types de cellules à la surface du péritoine, y compris des fibroblastes, des adipocytes et des cellules mésothéliales, et une communication bidirectionnelle entre les cellules cancéreuses et les cellules peritoneales sont supposés jouer un rôle clé dans la conduite du processus métastatique 2. Une fois maîtrisé, le protocole décrit ci-après est facilement adaptable à l'étude de ces interactions à l'intérieur de la micro-péritonéale, par exemple, par l'addition de cytokines exogènes, facteurs de croissance, ou des inhibiteurs spécifiques aux chambres supérieure ou inférieure de la plaque CIM puits ou d'une manipulation génétique du cancer ou des lignées de cellules péritonéales. En outre, cette méthode peut être utilisée avec des cellules tumorales ovariennes primaires fraîchement récoltées à partir d'ascites malignes et / ou des cellules primaires du péritoine pour mieux comprendre directe dans les signaux de régulation et les interactions cellulaires qui gouvernent la création d'une lésion métastatique à l'intérieur de la cavité péritonéale <sjusqu'à> 2.
L'utilisation de l'instrument RTCA pour mesurer la capacité d'invasion des cellules ou des sphéroïdes simples offre plusieurs avantages par rapport aux tests finaux simples classiques et analyse d'image temps-lapse. L'instrument mesure la RTCA invasion cellulaire à des intervalles définis de façon continue au cours d'un dosage, ce qui peut prendre des heures ou des jours. Cela permet la détermination des changements dans le taux d'invasion dans le temps, qui surmonte les limitations des essais de point de terminaison unique. Par exemple, l'examen des données de l'invasion des différentes lignées cellulaires de cancer à un seul critère (figure 2), par exemple, 3 heures, aurait pu conduire à la conclusion erronée que KGN et OVCA433 cellules étaient beaucoup plus invasive que OVCA429 cellules. Un autre avantage de cette technologie est que l'instrument RTCA mesure les variations de l'impédance électrique. Cela signifie que les tests peuvent être exécutés sans marquage des cellules avec un agent exogène, ce qui pourrait avoir des effets inattendus sur phen cellulaireOTYPE ou fonction. Cela devient particulièrement important lorsque l'on étudie les cellules cancéreuses ovariennes primaires dérivés de l'ascite maligne, avec lesquels il est impératif de garder les manipulations au minimum afin d'éviter l'introduction de changements moléculaires et phénotypiques qui ne sont pas le reflet de leur nature in vivo 2. En outre, l'utilisation de l'instrument RTCA permet la collecte de données quantitatives en temps réel, ce qui, non seulement évite la fastidieuse analyses associées à la microscopie time-lapse mais également permet la détermination rapide de fenêtres expérimentales clés pour l'optimisation du dosage. Ceci est particulièrement utile lorsque l'on compare les effets d'une série de facteurs sur l'invasion sphéroïde, comme différents facteurs peuvent exercer leurs effets maximaux à différents points dans le temps ou avec beaucoup profils différents au fil du temps.
Bien que ce protocole est susceptible de modifications (par exemple, l'utilisation de différents matrice ECM, différentes lignées cellulaires de cancer, ou différents cel ciblels), si une telle mesure, il est important de noter que les diverses conditions expérimentales doivent d'abord être optimisés. Par exemple, avant de commencer les études d'invasion sphéroïde, le nombre optimal de cellules cancéreuses / plaque CIM puits doit tout d'abord être déterminée par dosage du nombre de cellules dans les titrages culture monocouche. Le nombre optimal de sphéroïdes à utiliser par puits est alors basé sur cette analyse. Par exemple, dans le procédé actuel, sphéroïdes comprennent environ 3000 cellules lorsque chaque première généré. Si initiales titrages nombre de cellules indiquent que 30 000 cellules monocouche sont optimales pour la détection dans l'invasion des analyses, puis 10 sphéroïdes sont ajoutés par plaque de CIM bien. En outre, lorsque la conduite d'expériences de co-culture, il est important d'étudier les comportements de la monocouche de cellule «cible» séparément afin de déterminer si ces cellules sont par nature invasive, ce qui pourrait brouiller les résultats. Dans l'exemple montré, les sphéroïdes de cancer sont plaquées sur le dessus d'une cellule Monola LP9yer, avec et sans FBS ajouté au bas ainsi qu'un chemoattractant. En parallèle, les cellules sont cultivées LP9 seul, dans chaque condition de traitement.
De même, lorsque l'on étudie la capacité d'invasion des cellules et des sphéroïdes, il est également important d'examiner leurs capacités migratoires ainsi afin de distinguer les deux comportements (c.-à-invasion nécessite la digestion protéolytique d'une barrière ECM alors que la migration ne fonctionne pas). Pour ce faire, omettre la barrière de l'ECM (3.1.1 – 3.1.3) et effectuer le test en parallèle avec la barrière de l'ECM en place. Cette dernière mesure «d'invasion» peut être corrigée à l'ancienne mesure de «migration», si désiré. Enfin, il est important de noter que les informations obtenues à partir de mesures de l'impédance électrique d'une portée limitée: une fois que les cellules ont envahi dans la chambre inférieure, les variations de leur fixation, la propagation, la prolifération et sur la face inférieure de la membrane peuvent contribuer aux changements de impédance reabosses. Par conséquent, cette méthode est la plus informative lorsqu'il est utilisé conjointement avec d'autres tests de viabilité sphéroïde cellulaire, l'adhérence, la migration et la morphologie afin d'évaluer globalement les comportements cellulaires sphéroïde. Par exemple, dans l'idéal, afin de bien comprendre les interactions sphéroïde mésothéliales, co-cultures distinctes devraient également être visualisés périodiquement en microscopie de phase standard, de sorte que les évaluations qualitatives des sphéroïde morphologie et de la santé peuvent être faites en parallèle avec les tests RTCA quantitatives de l'invasion. Si l'étape de marquage facultatif est effectué, puis les comportements des cellules cancéreuses individuelles peuvent être déterminées par microscopie fluorescente ils ventilent de la sphéroïde et interagissent avec les cellules mésothéliales non étiquetés. Un avantage supplémentaire de marquage par fluorescence les cellules cancéreuses lors de la co-culture avec un second type de cellule est qu'il est alors possible de confirmer que seules les cellules cancéreuses ont envahi à travers les barrières cellulaires et ECM.
<p class="jove_content"> En résumé, cette méthode représente une analyse quantitative à haut débit de l'ovaire invasion sphéroïde de cancer de mésothéliales et ECM obstacles. Grâce à l'addition de cytokines exogènes, facteurs de croissance, ou des inhibiteurs spécifiques aux cavités supérieures ou inférieures de la plaque de CIM ainsi, ce procédé permet un rapide, la détermination des facteurs qui régulent les interactions entre les cellules sphéroïdes de cancer de l'ovaire invasion à travers mésothéliales et les barrières de matrice au-dessus de temps.The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par une fondation CASS sciences et de médecine de subvention; (MB); une Santé et médecine du Conseil national de recherches du projet Australie Grant (KLS, 338516); et par Programme opérationnel d'appui aux infrastructures du gouvernement du Victoria (Australie).
xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
Methylcellulose (4000 centipose) | Sigma | M0512 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |