JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Quimica

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Published: January 15, 2014
doi:
10.3791/51185
, , , , ,
1Department of Biomedical and Molecular Sciences,Queen’s University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke,Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Antifriz proteinleri (AFP’ler) buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için belirli buz düzlemlerine bağlanır. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AFP’ye bağlı buz düzlemlerinin belirlenmesi için orijinal buz aşındırma yönteminin bir modifikasyonudur. AFP’ler floresan olarak etiketlenir, makroskopik tek buz kristallerine dahil edilir ve UV ışığı altında görselleştirilir.

Abstract

Antifriz proteinleri (AFP’ler), iç buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için çeşitli soğuk sert organizmalarda ifade edilir. AP’ler buz bağlayıcı yüzeylerinden belirli buz düzlemlerine bağlanırlar. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AP’lerin bağlandığı buz düzlemlerini belirlemek için kullanılan değiştirilmiş bir tekniktir. FIPA, AFP’ye bağlı buz düzlemlerini belirlemek için orijinal buz aşındırma yöntemine dayanmaktadır. Kısaltılmış deneysel sürede daha net görüntüler üretir. FIPA analizinde, AFP’ler floresan olarak bir kimerik etiket veya kurvalent boya ile etiketlenir, daha sonra yavaşça bir yarımküreye önceden biçimlendirilmiş ve a ve ceksenlerini belirlemeye yönelik makroskopik tek bir buz kristaline dahil edilir. AFP’ye bağlı buz yarımküresi, spesifik olmayan ışığı engellemek için filtreler kullanarak AFP’ye bağlı düzlemleri görselleştirmek için UV ışığı altında görüntülenir. AFP’lerin floresan etiketlemesi, AFP adsorpsiyonunun buza gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Etiketlerin, AFP’lerin bağlandığı uçakları etkilemediği bulunmuştur. FIPA analizi ayrıca, bağlama düzlemlerini ayırt etmeye yardımcı olmak için aynı tek buz kristaline birden fazla farklı etiketli AFP bağlama seçeneği sunar. FIPA’nın bu uygulamaları, AFP’lerin büyümesini durdurmak için buza nasıl bağlanıp bağlanmasını ve birçok AFP üreten organizmanın neden birden fazla AFP izoformunu ifade ettiğini anlamamızı ilerletmeye yardımcı oluyor.

Introduction

Antifriz proteinlerinin (AFP) üretimi, buz yüklü ortamlarda yaşayan bazı organizmaların önemli bir hayatta kalma mekanizmasıdır. Yakın zamana kadar, AFP’lerin tek işlevinin dolaşımı engelleyecek, doku hasarına ve ozmotik strese neden olacak iç buz kristallerinin büyümesini önlemek veya yavaşlatmak olduğu düşünülüyordu. Balık gibi herhangi bir donma derecesini tolere edemeyen organizmalar, buz kristali büyümesini tamamen engellemek için AFP’leri ifade eder1. Çim gibi diğerleri, donmaya karşı dayanıklıdır ve dokularında büyük buz kristallerinin oluşumunu azaltan buz rekristalizasyonunu inhibe etmek için AFP’leri ifade eder2. Düşük sıcaklıktaki membranların stabilizasyonu, AFP’ler için önerilen başka bir işlevdir3. Son zamanlarda, bir Antarktika bakterisinin AFP’si için yeni bir rol önerildi, Marinomonas primoryensis, buzla kaplı acı göllerden4. Bu AFP, oksijen ve besin maddelerine daha iyi erişim için bakteriyi buza tutturdığı düşünülen çok daha büyük bir adhesinproteini 5’inbir parçasıdır 6 . Diğer mikropların, içinde yaşadıkları buzun yapısını değiştirebilecek AP’leri salgıladığı bilinmektedir7.

AFP’ler bazı balıklarda, böceklerde, bitkilerde, alglerde, bakterilerde, diatomlarda ve mantarlarda bulunmuştur. Çeşitli durumlarda farklı soydaşlardan evrimleriyle tutarlı son derece farklı dizilere ve yapılara sahiptirler; ve yine de hepsi buza bağlanır ve adsorpsiyon-inhibisyon mekanizması ile büyümesini engeller8. AP’lerin her biri, buz bağlama bölgesi (IBS) görevi görür. Bunlar tipik olarak9-11yüzey kalıntılarının bölgeye yönlendirilmiş mutajenisi ile tanımlanmıştır. IBS, su moleküllerini belirli buz düzlemleriyle eşleşen buz benzeri bir desende düzenlemek için hipotezlenmiştir. Böylece AFP ligandını bağlamadan önce oluşturur5, 12. Buz uçakları Miller endeksleri tarafından tanımlanabilir ve farklı AFP’ler farklı düzlemlere bağlanabilir. Bu nedenle, kış flounder’ından tip I AFP, 20-21 piramit düzlemlerinebağlanır 13, tip III AFP, bileşik bir buz bağlayıcı yüzey11,14kullanarak hem birincil prizma hem de piramit düzlemlerini bağlar, hiperaktif bir AFP olan ladin budworm AFP ise hem birincil hem de bazal uçaklara aynı andabağlanır 15,16. MpAFP gibi diğer hiperaktif AFP’ler, tek buz kristali yarımkürelerinin tam kapsamı ile gösterildiği gibi birden fazla buz düzlemine bağlanır5,17. Hiperaktif AFP’lerin bazal düzlemi ve diğer uçakları bağlama yeteneğinin, orta derecede aktif AFP’ler18üzerinde 10 kat daha yüksek aktivitelerini hesaba katabileceği varsayılmaktadır. Hiperaktif AFP’lerin verimliliği iyi belgelenmiş olsa da, birden fazla buz düzlemine bağlanma yetenekleri hala anlaşılamamıştır.

AFP’ye bağlı buz uçaklarını belirlemek için orijinal yöntem Charles Knight13,19tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde, makroskopik tek bir buz kristali içi boş bir metal çubuğa (soğuk parmak) monte edilir ve gazsız suyla dolu yarım küreye batırılarak yarımküreye oluşturulur. Daha sonra, yarımküre seyreltilmiş bir AFP çözeltisine batırılır ve AFP çözeltisinden buz kristali yarımküresine soğuk parmaktan dolaşan etilen glikolün sıcaklığı tarafından kontrol edilen birkaç saat içinde bir buz tabakası yetiştirilir. Buz kristali çözeltiden çıkarılır, soğuk parmaktan ayrılır ve -10 ila -15 ° C dondurucu odasına yerleştirilir. Yüzey, antifriz protein çözeltisinin donmuş yüzey filmini çıkarmak için keskin bir bıçakla kazınmıştır ve buz kristalinin en az 3 saat boyunca yüce olmasına izin verilir. Süblimasyondan sonra, AFP’ler tarafından bağlanan buz düzlemleri, artık proteinden elde edilen beyaz kazınmış desenler olarak görülebilir. Buz yarımküre, buzun bazal ve prizma düzlemlerini bulmak ve kazınmış yamaların Miller endekslerini belirlemek için ceksenine ve bir-eksenlerine yönlendirilebilir.

Burada, FLORESAN bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA)11olarak adlandırdığımız bir yöntem olan AFP’ye bağlı buz düzlemlerini belirlemek için orijinal yöntemin bir değişikliğini açıklıyoruz. AFP’ler, yeşil floresan protein (GFP)11,16,17,20gibi bir kimerik etiketle veya AFP5,21’eyaygın olarak bağlı bir floresan boya ile floresan olarak etiketlenmiştir. Floresan etiketli AFP’ler tek bir buz kristaline adsorbe edilir ve orijinal buz aşındırma deneyleriyle aynı deneysel prosedür kullanılarak büyür. AFP’nin büyüyen buz yarımküreye bağlanmasının boyutu, deney boyunca ultraviyole (UV) lamba kullanılarak izlenebilir. Deney tamamlandıktan sonra, yarımküre doğrudan soğuk parmaktan çıkarılabilir ve süblimasyon olmadan görüntülenebilir. Bununla birlikte, istenirse, yarımküre geleneksel bir buz kazımasını görselleştirmek için yüce bırakılabilir. FIPA metodolojisine getirilen değişiklikler, geleneksel buz aşındırma protokolünü birkaç saat kısaltır. Ayrıca, AFP’ye bağlı buz düzlemlerinin çakışan desenlerini görselleştirmek için her biri farklı bir floresan etikete sahip birkaç AFP’yi aynı anda görüntüleme potansiyeli vardır.

Protocol

1. Büyüyen Tek Buz Kristalleri Etilen glikol soğutma banyosuna uyan ve üzerinde yüzebilen temiz bir metal tava (15 cm çapında, 4,5 cm yüksekliğinde) alın. Bir borudan kesitler keserek polivinil klorür (PVC) silindirik kalıplar (4,5 cm çapında, 3-4 cm yüksekliğinde, 4 mm kalınlığında) hazırlayın. Bir tarafta (1 mm genişliğinde, 2 mm yüksekliğinde) bir çentik kesin (Şekil 1A). Tavaya rahatça sığabilecek kadar kalıp hazırlayın …

Representative Results

Tek buz kristalinin hazırlanması ve montajı, hataların en sık yapıldığı FIPA prosedürünün iki adımıdır. Hazırlanan buz kristalinin tek olup olmadığının belirlenmesi, protokol bölümünün 2.1. FIPA analizi için çok kanallı bir buz kristali kullanılırsa, sonuç, tutarlı bir bağlama deseni olmadan yarımküredeki AFP’lerin süreksiz bağlanması olacaktır (Şekil 6B). Buz kristali arayüzleri, AFP’nin bağlandığı buz düzlemlerinin etrafında bulunuyorsa, ni…

Discussion

AFP’ye bağlı buz uçaklarının belirlenmesi için Charles Knight tarafından buz aşındırma yönteminin geliştirilmesi, AFP’ler tarafından buz bağlama mekanizması üzerinde büyük ölçüde ileri çalışmalar. AFP’lerin yapıları X-ışını kristalografisi26,27 ile çözülebilirken, AFP’nin bağlı olduğu buz üzerindeki tamamlayıcı yüzeyi çıkarmak için belirgin bir yöntem yoktu. Kış flounder tip I AFP başlangıçta karakterize edildiğinde, buz birincil prizma düzlemleri bağlamak i?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

PLD, Protein Mühendisliğinde Kanada Araştırma Başkanı’na sahiptir. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri’nden PLD’ye verilen bir hibe ile finanse edildi. Bu çalışma ayrıca Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS) (No. 23310171) ve Japonya Biyo-odaklı Teknoloji Araştırma İlerleme Kurumu’ndan (BRAIN) bilimsel araştırmalar için bir Grant-in-Aid tarafından desteklendi. Dr. Chris Marshall ve Mike Kuiper’e FIPA’ya yol açan öncü çalışmalar için minnettarız. Ayrıca, bu çalışmaların bazıları için olanak sağladığı için Dr. Sakae Tsuda’ya ve floresan ışık ekscitasyon ve emisyon filtrelerini kurduğu için Dr. Laurie Graham’a minnettarız.

Materials

NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
  2. Sidebottom, C., et al. Phytochemistry – heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
  3. Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
  4. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.”>Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
  5. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
  6. Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
  7. Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
  8. Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
  9. Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
  10. Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
  11. Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Bioquímica. 49 (42), 9063-9071 (2010).
  12. Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
  13. Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
  14. Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
  15. Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
  16. Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
  17. Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
  18. Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
  19. Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
  20. Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
  21. Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
  22. Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
  23. Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ”perfect” ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
  24. Hobbs, P. V. . Ice physics. , 200-248 (1974).
  25. Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
  26. Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
  27. Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
  28. Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
  29. Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
  30. Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
  31. Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Bioquímica. 49 (11), 2593-2603 (2010).
  32. Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
  33. Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
  34. Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
  35. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).

Tags

Antifreeze ProteinsIce-binding PlanesFluorescence-based Ice Plane AffinityIce-etching MethodFluorescent LabelingSingle Ice CrystalIce GrowthAFP Isoforms

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image