蛍光ベースの氷面アフィニティーによる不凍タンパク質の氷結合平面の決定

不凍タンパク質(AMP)の生産は、氷を含んだ環境に生息する一部の生物の重要な生存メカニズムです。最近まで、AMPの唯一の機能は、循環を妨げ、組織損傷、浸透ストレスを引き起こす内部氷結晶の成長を予防または遅くすることであると考えられていた。魚のようないかなる程度の凍結を許容できない生物は、氷晶成長を完全に阻害するAMPを発現する^1。草などの他の人は、凍結耐性であり、それらの組織中の大きな氷の結晶の形成を減少させる氷再結晶を阻害するAMPを発現する^2。低温での膜の安定化は、AfPS3に対して提案されたもう一つの機能です。最近、氷に覆われた汽水湖⁴から南極細菌マリノモナスプリモレンシスのAFPに新しい役割が示唆された。このAFPは、酸素と栄養素へのより良いアクセスのために細菌を氷に付着すると考えられているはるかに大きなアフェシンタンパク質⁵の一部である^6。他の微生物は、彼らが住んでいる氷の構造を変更する可能性があるAMPを分泌することが知られています⁷.

AMPは、いくつかの魚、昆虫、植物、藻類、細菌、珪藻類、および真菌で発見されています。彼らは様々な機会に異なる前駆者からの進化と一致する著しく発散的な配列と構造を有する。しかし、それらはすべて氷に結合し、吸着阻害メカニズム⁸によってその成長を阻害する。AfP はそれぞれ、氷結合部位(IBS)として機能する特定のサーフェスを持っています。これらは、典型的には^、9-11の表面残基の部位特異的突然変異誘発によって同定された。IBSは、氷の特定の平面に一致する氷のようなパターンで水分子を配置するために仮説されています。したがって、AFPは^5,12に結合する前にリガンドを形成する。氷面はミラーインデックスによって定義することができ、異なるAMPは異なる平面に結合することができます。したがって、冬のヒラメからのタイプI AFPは20-21錐形の平面¹³に結合し、III型AFPは複合氷結合表面^11,14を使用して一次プリズムとピラミッド面の両方を結合し、スプルース・ブドワームAFPは多動性AFPである一次面と基礎面^15,16の両方に同時に結合する。 MPAFPなどの他の多動性AfPは、単一の氷結晶半球^5,17の完全なカバレッジによって示されるように、複数の氷面に結合する。これは、多動性AMPが基底面を結合する能力と他の平面が、適度に活動的なAMP¹⁸に対する10倍の高い活性を占める可能性があると仮定されている。多動性AMPの効率は十分に文書化されていますが、複数の氷面に結合する能力はまだ理解されていません。

AFPに結合した氷面を決定するための元の方法は、チャールズナイト^13,19によって開発されました。この方法では、マクロ的な単一の氷の結晶を中空の金属棒(冷指)に取り付け、脱気水で満たされた半球カップに水没させることによって半球に形成される。その後、半球はAFPsの希薄溶液に沈め、氷の層はAFP溶液から氷結晶半球に数時間にわたって成長し、冷たい指を循環するエチレングリコールの温度によって制御される。氷の結晶を溶液から取り出し、冷たい指から取り外し、-10〜-15°Cの冷凍室に入れた。表面を鋭い刃で削り取って不凍タンパク質溶液の凍結表面膜を除去し、氷晶を少なくとも3時間昇華させた。昇華後、AFPによって結合された氷面は、残留タンパク質に由来する白色のエッチングパターンと見なすことができる。氷半球は、そのc軸と-軸に向けて、氷の基底面およびプリズム平面を見つけ、エッチングされたパッチのミラー指数を決定することができます。

ここでは、AFP結合した氷の平面を決定するための元の方法の改変について述べているが、我々は蛍光ベースの氷面親和性^(FIPA)11と呼ぶ方法である。このAFPは、緑色蛍光タンパク質^{(GFP)11、16、17、20}などのキメラタグで蛍光標識されるか、またはAFP^5,21に共有結合した蛍光色素を有する。蛍光標識されたAFPは、単一の氷結晶に吸着され、元の氷エッチング実験と同じ実験手順を使用して生い茂る。成長する氷半球に対するAFP結合の程度は、紫外線(UV)ランプを使用して実験全体を通して監視することができる。実験が完了した後、半球は冷たい指から直接取り除かれ、昇華することなく画像化することができます。しかし、必要に応じて、半球を昇合したままにして、伝統的な氷のエッチングを視覚化することができます。FIPAの方法論に導入された変更は、従来の氷エッチングプロトコルを数時間短縮する。さらに、それぞれ異なる蛍光標識を持つ複数のAfPsを同時にイメージングして、AFP結合した氷面の重複するパターンを視覚化する可能性があります。