Determinando os planos de ligação de gelo de proteínas anticongelantes pela afinidade do plano de gelo baseado em fluorescência

A produção de proteínas anticongelantes (AFPs) é um importante mecanismo de sobrevivência de alguns organismos que vivem em ambientes carregados de gelo. Até recentemente, pensava-se que a única função das AFPs era prevenir ou retardar o crescimento de cristais de gelo internos que bloqueassem a circulação, causassem danos teciduais e estresse osmótico. Organismos que não toleram qualquer grau de congelamento, como peixes, expressam AFPs para inibir completamente o crescimento de cristais de gelo¹. Outros, como a grama, são tolerantes ao congelamento e expressam AFPs para inibir a recristalização do gelo que reduz a formação de grandes cristais de gelo em seus tecidos². A estabilização das membranas em baixa temperatura é mais uma função sugerida para as AFPs³. Recentemente, um novo papel foi sugerido para a AFP de uma bactéria antártica, Marinomonas primoryensis, dos lagos salgados cobertos de gelo⁴. Esta AFP faz parte de uma proteína de adesivo⁵ muito maior que se pensa em anexar a bactéria ao gelo para melhor acesso ao oxigênio e nutrientes⁶. Outros micróbios são conhecidos por segregar AFPs, o que pode alterar a estrutura do gelo em que vivem⁷.

AfPs foram encontrados em alguns peixes, insetos, plantas, algas, bactérias, diatomas e fungos. Eles têm sequências e estruturas notavelmente divergentes consistentes com sua evolução de diferentes progenitores em várias ocasiões; e ainda assim todos se ligam ao gelo e inibem seu crescimento pelo mecanismo de inibição de adsorção⁸. Cada um dos AFPs tem uma superfície específica que atua como seu local de ligação de gelo (IBS). Estes têm sido tipicamente identificados por mutagênese direcionada ao local de resíduos superficiais^9-11. O IBS é hipótese para organizar moléculas de água em um padrão semelhante ao gelo que corresponde a planos específicos de gelo. Assim, a AFP forma seu ligante antes de vinculá-lo a ele^{5, 12}. Aviões de gelo podem ser definidos por seus índices Miller, e diferentes AFPs podem se ligar a diferentes planos. Assim, o tipo I AFP do flounder de inverno liga-se aos 20-21 planos piramidários¹³, tipo III AFP liga tanto os planos prisma primário quanto o piramidal usando uma superfície composta de ligação de gelo^11,14, enquanto o budworm de abeto AFP, um AFP hiperativo, liga-se simultaneamente aos planos primários e basais^15,16. Outros AFPs hiperativos, como o MPAFP, ligam-se a múltiplos planos de gelo, como mostra a cobertura completa dos hemisférios de cristal de gelo^{único 5,17}. É hipótese, que a capacidade dos AFPs hiperativos de ligar o plano basal, bem como outros planos, pode explicar sua atividade 10 vezes maior sobre AFPs moderadamente ativa¹⁸. Embora a eficiência dos AFPs hiperativos esteja bem documentada, sua capacidade de se ligar a múltiplos planos de gelo ainda não é compreendida.

O método original para determinar os aviões de gelo com destino à AFP foi desenvolvido por Charles Knight^13,19. Neste método, um cristal de gelo único macroscópico é montado em uma haste de metal oca (dedo frio) e formado em um hemisfério submergindo-o em um copo hemisférico cheio de água desgassada. Em seguida, o hemisfério é submerso em uma solução diluída de AFPs e uma camada de gelo é cultivada a partir da solução AFP para o hemisfério cristal de gelo ao longo de várias horas controlada pela temperatura do glicol de etileno circulando através do dedo frio. O cristal de gelo é removido da solução, retirado do dedo frio, e colocado em uma sala de congelador de -10 a -15 °C. A superfície é raspada com uma lâmina afiada para remover o filme de superfície congelada da solução de proteína anticongelante e o cristal de gelo é permitido sublimar por pelo menos 3 horas. Após a sublimação, os planos de gelo ligados por AFPs podem ser vistos como padrões brancos gravados derivados de proteína residual. O hemisfério de gelo pode ser orientado para seu eixo ce eixos,para localizar os planos basais e prisma de gelo, e determinar os índices Miller das manchas gravadas.

Aqui descrevemos uma modificação do método original para determinar aviões de gelo vinculados à AFP, um método a que chamamos de afinidade de avião de gelo baseado em fluorescência (FIPA)¹¹. Os AFPs são fluorescentes rotulados com uma etiqueta quimrica, como proteína fluorescente verde (GFP)^11,16,17,20, ou com um corante fluorescente covalentemente ligado à AFP^5,21. Os AFPs fluorescentes são adsorvidos a um único cristal de gelo e crescidos usando o mesmo procedimento experimental que os experimentos originais de gravação de gelo. A extensão da ligação da AFP ao crescente hemisfério de gelo pode ser monitorada durante todo o experimento usando uma lâmpada ultravioleta (UV). Depois que o experimento estiver completo, o hemisfério pode ser diretamente retirado do dedo frio e imageado, sem sublimação. No entanto, se desejar, o hemisfério pode ser deixado para sublimar para visualizar uma etch de gelo tradicional. Modificações introduzidas na metodologia FIPA encurtam o protocolo tradicional de gravura de gelo em várias horas. Além disso, há o potencial de imagens simultâneas de vários AFPs, cada um com um rótulo fluorescente diferente, para visualizar os padrões sobrepostos de planos de gelo ligados à AFP.