Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Die Produktion von Frostschutzproteinen (AFPs) ist ein wichtiger Überlebensmechanismus einiger Organismen, die in eisbeladenen Umgebungen leben. Bis vor kurzem dachte man, dass die einzige Funktion von AFPs darin bestand, das Wachstum von inneren Eiskristallen zu verhindern oder zu verlangsamen, die die Durchblutung blockieren, Gewebeschäden verursachen und osmotischen Stress verursachen würden. Organismen, die kein Einfrieren vertragen, wie Fische, drücken AFPs aus, um das Eiskristallwachstum vollständig zu hemmen¹. Andere, wie Gras, sind frosttolerant und drücken AFPs aus, um die Eisrekristallisation zu hemmen, die die Bildung großer Eiskristalle in ihren Geweben reduziert². Die Stabilisierung von Membranen bei niedriger Temperatur ist eine weitere Funktion, die für die AFPs vorgeschlagen wurde³. Kürzlich wurde eine neue Rolle für die AFP eines antarktischen Bakteriums, Marinomonas primoryensis, aus eisbedeckten Brackseen^{vorgeschlagen 4}. Diese AFP ist Teil eines viel größeren Adhesin-Proteins^5, von dem angenommen wird, dass es das Bakterium an Eis anheftet, um einen besseren Zugang zu Sauerstoff und Nährstoffen zu erhalten⁶. Andere Mikroben sind dafür bekannt, AFPs zu sezernieren, was die Struktur des Eises, in dem sie leben, verändern könnte⁷.

AfPs wurden in einigen Fischen, Insekten, Pflanzen, Algen, Bakterien, Diatomen und Pilzen gefunden. Sie haben bemerkenswert unterschiedliche Sequenzen und Strukturen, die mit ihrer Entwicklung von verschiedenen Vorläufern bei verschiedenen Gelegenheiten übereinstimmen; und doch binden sie alle an Eis und hemmen sein Wachstum durch den Adsorptionsinhibitionsmechanismus⁸. Die AFPs haben jeweils eine bestimmte Oberfläche, die als eisbindende Stelle (IBS) fungiert. Diese wurden typischerweise durch standortgesteuerte Mutagenese von Oberflächenrückständen^9-11identifiziert. Die IBS wird vermutet, um Wassermoleküle in einem eisähnlichen Muster zu arrangieren, das bestimmten Eisebenen entspricht. So bildet die AFP ihren Liganden, bevor sie an sie bindet^{5, 12}. Eisebenen können durch ihre Miller-Indizes definiert werden, und verschiedene AFPs können an verschiedene Ebenen binden. So bindet Typ I AFP von Winterflunder an die 20-21 Pyramidenebenen¹³, Typ III AFP bindet sowohl primäre Prisma als auch Pyramidenebenen mit einer zusammengesetzten Eisbindungsfläche^11,14, während der Fichtenknospenwurm AFP, ein hyperaktiver AFP, gleichzeitig an die Primär- und Basalebene^15,16bindet. Andere hyperaktive AFPs, wie MpAFP, binden an mehrere Eisebenen, wie ihre vollständige Abdeckung von einzelnen Eiskristallhemisphären^{zeigt 5,17}. Es wird vermutet, dass die Fähigkeit von hyperaktiven AFPs, die Basalebene zu binden, sowie andere Ebenen, für ihre 10-fache höhere Aktivität gegenüber mäßig aktiven AFPs¹⁸verantwortlich sein kann. Obwohl die Effizienz hyperaktiver AFPs gut dokumentiert ist, ist ihre Fähigkeit, sich an mehrere Eisebenen zu binden, immer noch nicht verstanden.

Die ursprüngliche Methode zur Bestimmung der AFP-gebundenen Eisflugzeuge wurde von Charles Knight^13,19entwickelt. Bei dieser Methode wird ein makroskopischer Einzeleiskristall auf einen hohlen Metallstab (Kaltfinger) montiert und zu einer Hemisphäre geformt, indem er in einen halbkugelförmigen Becher mit entgastem Wasser getaucht wird. Dann wird die Hemisphäre in eine verdünnte Lösung von AFPs getaucht und eine Eisschicht wird von der AFP-Lösung auf die Eiskristall-Hemisphäre über mehrere Stunden angebaut, die durch die Temperatur des Ethylenglykols gesteuert wird, das durch den kalten Finger zirkuliert. Der Eiskristall wird aus der Lösung entfernt, vom kalten Finger gelöst und in einen Gefrierraum von -10 bis -15 °C gelegt. Die Oberfläche wird mit einer scharfen Klinge abgekratzt, um den gefrorenen Oberflächenfilm der Frostschutzproteinlösung zu entfernen, und der Eiskristall darf sich für mindestens 3 Stunden sublimieren. Nach der Sublimation können die eisebenen, die von AFPs gebunden sind, als weiß geätzte Muster gesehen werden, die aus Restproteinen abgeleitet sind. Die Eishalbkugel kann an ihrer c-Achseund a-Achsenausgerichtet werden, um die Basal- und Prismenebenen des Eises zu lokalisieren und die Miller-Indizes der geätzten Flecken zu bestimmen.

Hier beschreiben wir eine Modifikation der ursprünglichen Methode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen, eine Methode, die wir als fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität (FIPA)¹¹bezeichnen. Die AFPs sind fluoreszierend entweder mit einem chimären Etikett, wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP)^11,16,17,20, oder mit einem fluoreszierenden Farbstoff kovalent an die AFP^5,21gebunden. Die fluoreszierend markierten AFPs werden auf einen einzigen Eiskristall adsorbiert und mit dem gleichen experimentellen Verfahren wie die ursprünglichen Eisätzexperimente überwuchert. Das Ausmaß der AFP-Bindung an die wachsende Eishalbkugel kann während des gesamten Experiments mit einer ultravioletten (UV) Lampe überwacht werden. Nach Abschluss des Experiments kann die Hemisphäre direkt vom kalten Finger abgenommen und ohne Sublimation abgebildet werden. Wenn gewünscht, kann die Hemisphäre jedoch sublimiert werden, um einen traditionellen Eisätz zu visualisieren. Änderungen, die an der FIPA-Methodik vorgenommen wurden, verkürzen das traditionelle Eisätzprotokoll um mehrere Stunden. Darüber hinaus besteht das Potenzial, mehrere AFPs mit jeweils einem anderen fluoreszierenden Etikett gleichzeitig zu bebildern, um die überlappenden Muster von AFP-gebundenen Eisebenen zu visualisieren.