Het bepalen van de IJsbindende Vlakken van Antivries eiwitten door Fluorescentie-gebaseerde Ice Plane Affiniteit

De productie van antivrieseiwitten (ACP’s) is een belangrijk overlevingsmechanisme van sommige organismen die in met ijs beladen omgevingen leven. Tot voor kort werd gedacht dat de enige functie van ASP’s was om de groei van interne ijskristallen te voorkomen of te vertragen die de bloedsomloop zouden blokkeren, weefselschade en osmotische stress zouden veroorzaken. Organismen die geen enkele mate van bevriezing kunnen verdragen, zoals vissen, drukken ASP’s uit om de groei van ijskristallen volledig te remmen¹. Anderen, zoals gras, zijn vorsttolerant en drukken ACP’s uit om ijsrestallisatie te remmen, wat de vorming van grote ijskristallen in hun weefsels vermindert². Stabilisatie van membranen bij lage temperatuur is nog een andere functie die werd voorgesteld voor de APS³. Onlangs werd een nieuwe rol voorgesteld voor de AFP van een Antarctische bacterie, Marinomonas primoryensis, uit met ijs bedekte brakke meren⁴. Deze AFP maakt deel uit van een veel groter adhesine-eiwit⁵ waarvan wordt gedacht dat het de bacterie aan ijs hecht voor een betere toegang tot zuurstof en voedingsstoffen⁶. Van andere microben is bekend dat ze ASP’s afscheiden, wat de structuur van het ijs waarin ze leven kan veranderen⁷.

AFP’s zijn gevonden in sommige vissen, insecten, planten, algen, bacteriën, diatomeeën en schimmels. Ze hebben opmerkelijk uiteenlopende sequenties en structuren die consistent zijn met hun evolutie van verschillende voorlopers bij verschillende gelegenheden; en toch binden ze zich allemaal aan ijs en remmen ze de groei ervan door het adsorptieremmingsmechanisme⁸. De ASP’s hebben elk een specifiek oppervlak dat fungeert als zijn ijsbindende site (IBS). Deze zijn doorgaans geïdentificeerd aan de deen plaatsgerichte mutagenese van oppervlakteresiduen^9-11. De PDS wordt verondersteld om watermoleculen te rangschikken in een ijsachtig patroon dat overeenkomt met specifieke ijsvlakken. Aldus vormt AFP zijn ligand alvorens aan het te binden^{5, 12}. IJsvlakken kunnen worden gedefinieerd door hun Miller-indexen en verschillende ASP’s kunnen zich binden aan verschillende vlakken. Zo bindt type I AFP van winters bot aan de 20-21 piramidale^{vlakken 13}, type III AFP bindt zowel primaire prisma als piramidale vlakken met behulp van een samengesteld ijsbindend oppervlak^11,14, terwijl de sparrenknopworm AFP, een hyperactieve AFP, zich tegelijkertijd bindt aan zowel de primaire als basale^{vlakken 15,16}. Andere hyperactieve AFP’s, zoals MpAFP, binden zich aan meerdere ijsvlakken, zoals blijkt uit hun volledige dekking van enkele ijskristalhersenenhelften^5,17. Er wordt verondersteld dat het vermogen van hyperactieve ACP’s om het basale vlak te binden, evenals andere vlakken, hun 10-voudige hogere activiteit kan verklaren ten opzichte van matig actieve ASP’s¹⁸. Hoewel de efficiëntie van hyperactieve ACP’s goed gedocumenteerd is, wordt hun vermogen om zich te binden aan meerdere ijsvlakken nog steeds niet begrepen.

De oorspronkelijke methode voor het bepalen van de AFP-gebonden ijsvlakken werd ontwikkeld door Charles Knight^13,19. Bij deze methode wordt een macroscopisch enkel ijskristal op een holle metalen staaf (koude vinger) gemonteerd en gevormd tot een halfrond door het onder te dompelen in een hemisferische beker gevuld met ontgast water. Vervolgens wordt de hemisfeer ondergedompeld in een verdunde oplossing van AFP’s en wordt een laag ijs uit de AFP-oplossing gedurende enkele uren op de ijskristalhelft gekweekt, gecontroleerd door de temperatuur van de ethyleenglycol die door de koude vinger circuleert. Het ijskristal wordt uit de oplossing verwijderd, losgemaakt van de koude vinger en in een vriesruimte van -10 tot -15 °C geplaatst. Het oppervlak wordt geschraapt met een scherp mes om de bevroren oppervlaktefilm van antivries-eiwitoplossing te verwijderen en het ijskristal mag minstens 3 uur sublimeren. Na sublimatie kunnen de ijsvlakken die door APS’s worden gebonden, worden gezien als wit geëtste patronen afgeleid van resteiwit. De ijshelft kan worden georiënteerd op zijn c-as en een-assen, om de basale en prismavlakken van ijs te lokaliseren en de Miller-indexen van de geëteerde plekken te bepalen.

Hier beschrijven we een wijziging van de oorspronkelijke methode voor het bepalen van AFP-gebonden ijsvlakken, een methode die we fluorescentiegebaseerde ijsvlakaffiniteit (FIPA)¹¹noemen. De AFP ‘s zijn fluorescerend gelabeld met ofwel een chimerische tag, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP)^11,16,17,20, of met een fluorescerende kleurstof die covalent gebonden is aan de AFP^5,21. De fluorescerend gelabelde ARP’s worden geadsorbeerd tot een enkel ijskristal en overwoekerd volgens dezelfde experimentele procedure als de oorspronkelijke ijsetsexperimenten. De mate van AFP-binding aan de groeiende ijshelft kan tijdens het experiment worden gecontroleerd met behulp van een ultraviolette (UV) lamp. Nadat het experiment is voltooid, kan de hemisfeer direct van de koude vinger worden verwijderd en worden afgebeeld, zonder sublimatie. Indien gewenst kan de hemisfeer echter worden overgelaten aan sublimate om een traditionele ijst ets te visualiseren. Wijzigingen in de FIPA-methodologie verkorten het traditionele ijsetsprotocol met enkele uren. Bovendien is er het potentieel om tegelijkertijd verschillende AFP’s, elk met een ander fluorescerend label, in beeld te brengen om de overlappende patronen van AFP-gebonden ijsvlakken te visualiseren.