Inyección ortotópica: Implantación de células cancerosas específicas del tejido en un ratón adulto

1. Preparación de células (para 10 ratones)

NOTA: Las células deben inocularse dentro de 1 h después de ser separadas del plato para evitar una disminución de la viabilidad celular. Específicamente, la suspensión celular debe mezclarse en la mezcla de proteína gelatinosa en un plazo de 15 minutos después de separar las células del plato para mantener su viabilidad.

1. Cultivo 4T1-luc2 células, una línea celular de adenocarcinoma mammary ratón que expresa luciferasa, en medios RPMI 1640 con 10% FBS en una incubadora humidificada a 37 °C en 5% CO_2.
2. Lave las células adherentes de 4T1-luc2 en un plato de 10 cm con solución salina amortiguada por fosfato (PBS) con una pipeta serológica de 10 ml. Añadir 1 ml de 0.25% de trippsina usando una pipeta P1000 y, a continuación, incubar la muestra a 37 °C durante 5 minutos. Luego, agregue 4 ml de medios de crecimiento (RPMI-1640 con un 10% de FBS) usando una pipeta serológica de 5 ml y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml en una campana de cultivo tisular. Centrífuga la suspensión celular a 180 x g durante 5 minutos.
3. Aspirar el sobrenadante y resuspend las células en 2 mL de PBS; luego, cuente las células usando el hemociclo.
4. Suspenda 2 células 10⁶ 4T1-luc2 en 40 μL de PBS frío (pH 7.4, 4 °C) en la campana de cultivo de tejido.
5. Mezcle la suspensión celular de 40-μL con 360 μL de la mezcla de proteína gelatinosa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de hielo en la campana del cultivo tisular.
   NOTA: La concentración final es de1 x 10 5/20 μL (1:9 PBS:mezcla de proteína gelatinosa). Para el modelo ortotópico (sin mastectomía),se utilizó 1 x 10 4/20 μL de la concentración final, para evitar alcanzar criterios de eutanasia (tamaño del tumor > 2 cm) en dos semanas.

2. Inoculación de células cancerosas

1. Ponga a los ratones en la cámara de inducción de anestesia con un 2-4% de isoflurano y un flujo de oxígeno de 0,2 L/min hasta que los ratones respiren con calma (2-3 min).
2. Sujete el ratón e inyecte 0,05 mg/kg de buprenorfina en su hombro por vía subcutánea.
3. Confirme la anestesia adecuada por la falta de reacción a un pellizco de dedo del pie. Inserte la nariz del ratón en el orificio de la máscara del ratón, lo que permite anestesia inhalacional con 2-4% de isoflurano y 2 L/min de flujo de oxígeno unido a una unidad de bote de carbón.
4. Restrinja las extremidades del ratón usando cinta de laboratorio y esterilizar su piel usando clorhexidina, yodo y 75% etanol, usando hisopos de algodón.
5. Hacer una incisión de la piel de 5 mm en el medio de la pared torácica anterior utilizando tijeras estériles de microdisección, levantar la piel del lado derecho junto a la incisión y separar la piel de la pared torácica usando las tijeras, y luego, invertir la piel para exponer el #2 almohadilla de grasa mamaria correcta.
6. Inyecte cuidadosamente 20 μL de suspensión de células cancerosas utilizando una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja de 28,5 G en la almohadilla de grasa bajo visión directa a través de la herida.
   NOTA: La aguja pasa a través de la herida, no de la piel. Mantenga la aguja en la almohadilla de grasa durante 5 s antes de extraerla, lo que da tiempo para que la mezcla de proteína gelatinosa se solidifique.
7. Cierre las incisiones de la piel cosiendo, usando suturas estériles 5-0 no absorbibles.
8. Después de la cirugía, devuelva a los animales a una jaula limpia y monitoree hasta que se hayan recuperado y se muevan libremente (después de ~1–2 min). Si un animal no parece estar en buen estado de salud dentro de las 24 h de la cirugía, administrar buprenorfina (0,2 mg/kg).
9. Retire las suturas bajo anestesia (ver paso 2.1) 7 d después de la cirugía.