정형소 주입 : 성인 마우스에 조직 특정 암세포를 이식

1. 세포 준비 (10 마우스용)

참고: 세포는 감소 된 세포 생존을 피하기 위해 접시에서 분리 된 후 1 시간 이내에 접종해야합니다. 특히, 세포 현탁액은 생존력을 유지하기 위해 접시에서 세포를 분리한 후 15분 이내에 젤라틴 단백질 혼합물로 혼합되어야 한다.

1. 배양 4T1-luc2 세포, 루시파라제를 발현하는 마우스 유방 아데노시종 세포주, RPMI 1640 배지에서 37°C에서 가습된 인큐베이터에서 10% FBS를 5%_CO2로증식하였다.
2. 10mL 세로지피펫을 사용하여 인산염 완충식식염수(PBS)로 10cm 접시에 부착된 4T1-luc2 세포를 세척한다. P1000 파이펫을 사용하여 0.25% 트립신 1mL을 추가한 다음 샘플을 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 이어서, 5mL 세로지학적 파이펫을 사용하여 4mL의 성장 미디어(RPMI-1640+10% FBS)를 추가하고 조직 배양 후드에서 세포 현탁액을 15mL 원문 튜브로 전송한다. 5 분 동안 180 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다.
3. 슈퍼나탈을 흡인시키고 PBS의 2mL에서 세포를 재일시 중단; 그런 다음 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다.
4. 조직 배양 후드에서 감기 PBS(pH 7.4, 4°C)의 40 μL에서 2 x 10⁶ 4T1-luc2 세포를 일시 중단한다.
5. 40-μL 세포 현탁액을 젤라틴 단백질 혼합물의 360 μL과 결합하여 조직 배양 후드의 얼음 에 1.5 mL 마이크로 센심분리기 튜브에 혼합한다.
   참고: 최종 농도는 1 x10 5/20 μL(1:9 PBS:젤라틴 단백질 혼합물)입니다. 직교 모델 (유방 절제술 없음)의 경우, 최종 농도의 1 x 10⁴/20 μL이 사용되어 2 주 이내에 안락사 기준 (종양 크기 > 2cm)에 도달하지 않도록했습니다.

2. 암세포 접종

1. 마우스가 침착하게 호흡할 때까지 2-4%의 이소플루란과 0.2 L/min 산소 흐름을 가진 마취 유도챔버에 마우스를 넣습니다(2-3분).
2. 마우스를 잡고 0.05 mg/kg buprenorphine를 어깨에 피하시 주입하십시오.
3. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족에 의해 적절한 마취를 확인합니다. 마우스 마스크의 구멍에 마우스의 코를 삽입하여 흡입 마취를 2-4% 이소플루란과 숯 통에 부착된 2 L/min 산소 흐름으로 허용합니다.
4. 실험실 테이프를 사용하여 마우스의 팔다리를 억제하고 면 봉면을 사용하여 클로르헤시딘, 요오드 및 75 % 에탄올을 사용하여 피부를 살균하십시오.
5. 멸균 미세 절 가위를 사용하여 전방 가슴 벽의 중간에 5mm 피부 절개를 하고 절개 옆에 오른쪽 피부를 들어 올리고 가위를 사용하여 가슴 벽에서 피부를 분리한 다음 피부를 반전하여 유방 지방 패드에 올바른 #2 노출시십시오.
6. 상처를 통해 직접 시야하에 28.5 G 바늘을 가진 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 암 세포 현탁액 20 μL을 조심스럽게 주입합니다.
   참고: 바늘은 피부가 아닌 상처를 통과합니다. 바늘을 지방 패드에 5 s로 잡아 당기기 전에 계속 유지하여 젤라틴 단백질 혼합물이 고화될 수 있도록 합니다.
7. 멸균 5-0 비 흡수성 봉합사를 사용하여 스티치하여 피부 절개를 닫습니다.
8. 수술 후, 깨끗한 케이지에 동물을 반환하고 그들이 회복하고 자유롭게 이동할 때까지 그들을 모니터링 (후 ~ 1-2 분). 동물이 수술 24 시간 이내에 건강상태가 좋지 않은 것으로 나타나지 않으면 부프레노르핀 (0.2 mg /kg)을 투여하십시오.
9. 마취 하에 봉합사를 제거하십시오 (2.1 단계 참조) 7 d 수술 후.