正体注射:組織特異的がん細胞を成人マウスに移植する

1. 細胞の作製(10匹のマウス)

注:細胞の生存率の低下を避けるために、皿から剥離した後、細胞を1時間以内に接種する必要があります。具体的には、細胞懸濁液は、細胞をその生存率を維持するために皿から切り離した後、15分以内にゼラチン性タンパク質混合物に混合する必要があります。

1. 培養4T1-luc2細胞は、ルシファーゼを発現するマウス乳腺腺癌細胞株であり、5%CO2で37°Cで加湿インキュベーター中の10%FBSを有するRPMI 1640培地中で。
2. 10 mL血清ピペットを使用して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で付着した4T1-luc2細胞を10cm皿で洗浄します。P1000ピペットを使用して0.25%トリプシンの1mLを加え、37°Cで5分間インキュベートします。次に、5 mL 血清ピペットを用いて4 mLの成長培地(RPMI-1640、10% FBS)を加え、細胞懸濁液を組織培養フード内の15 mL円錐形チューブに移します。細胞懸濁液を180xgで5分間遠心分離する。
3. 上清を吸引し、PBSの2 mLで細胞を再懸濁する;次に、ヘモサイトメーターを用いて細胞を数える。
4. 2 x 10⁶ 4T1-luc2細胞を40 μLの冷たいPBS(pH 7.4,4°C)の組織培養フードに懸濁させる。
5. 40-μLの細胞懸濁液をゼラチン性タンパク質混合物の360 μLと混合し、1.5 mLマイクロ遠心チューブを組織培養フードの氷の上に入れます。
   注:最終濃度は1 x 10⁵/20 μL(1:9 PBS:ゼラチン状タンパク質混合物)です。正体異物モデル(乳房切除術なし)では、2週間以内に安楽死基準(腫瘍サイズ>2cm)に達することを避けるために、最終濃度の1 x 10⁴/20 μLを使用した。

2. がん細胞接種

1. マウスが落ち着いて呼吸するまで、2-4%のイオブルランと0.2 L/分の酸素流で麻酔誘導室にマウスを入れます(2〜3分)。
2. マウスをつかみ、0.05mg/kgブプレノルフィンを肩に皮下に注入します。
3. つま先ピンチに対する反応の欠如によって十分な麻酔を確認する。マウスマスクの穴にマウスの鼻を挿入し、2-4%のイオブルランと2 L/分酸素流を炭キャニスターユニットに取り付けた吸入麻酔を可能にします。
4. ラボテープを使用してマウスの手足を拘束し、綿棒を使用してクロルヘキシジン、ヨウ素、および75%エタノールを使用して皮膚を殺菌します。
5. 無菌マイクロディションハサミを利用して前胸壁の真ん中に5mmの皮膚切開を行い、切開の隣の皮膚を持ち上げ、はさみを使用して胸壁から皮膚を切り離し、皮膚を反転して右#2乳腺脂肪パッドを露出させます。
6. 28.5G針の1mLインスリン注射器を使用して、20μLの癌細胞懸濁液を創傷を通して直接視力下の脂肪パッドに慎重に注入します。
   注:針は皮膚ではなく傷口を通る。引き出す前に5分間脂肪パッドに針を保持し続け、ゼラチン状タンパク質混合物を固める時間を与えます。
7. 縫製によって皮膚切開を閉じ、無菌5-0非吸収性縫合糸を使用する。
8. 手術後、動物を清潔なケージに戻し、回復して自由に動くまで監視します(〜1〜2分後)。動物が手術の24時間以内に健康でないと思われる場合は、ブプレノルフィン(0.2 mg/kg)を投与してください。
9. 手術後、麻酔下で縫合を取り除く(ステップ2.1を参照) 7 d.