Injection orthotopique : Implantation de cellules cancéreuses spécifiques aux tissus dans une souris adulte

1. Préparation des cellules (pour 10 souris)

REMARQUE: Les cellules doivent être inoculées dans les 1 h après avoir été détachées du plat pour éviter une diminution de la viabilité cellulaire. Plus précisément, la suspension cellulaire doit être mélangée dans le mélange de protéines gélatineuses dans les 15 minutes après avoir détaché les cellules du plat pour maintenir leur viabilité.

1. Culture 4T1-luc2 cellules, une lignée cellulaire adénocarcinome mammaire de souris exprimant luciferase, dans rpmi 1640 médias avec 10% FBS dans un incubateur humidifié à 37 °C en 5% CO₂.
2. Lavez les cellules adhérentes 4T1-luc2 dans un plat de 10 cm avec de la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % à l’aide d’une pipette P1000, puis incuber l’échantillon à 37 °C pendant 5 min. Ensuite, ajouter 4 mL de supports de croissance (RPMI-1640 avec 10% FBS) à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL dans une hotte de culture tissulaire. Centrifugeuse de la suspension cellulaire à 180 x g pendant 5 min.
3. Aspirer le supernatant et résusquer les cellules dans 2 mL de PBS; puis, comptez les cellules à l’aide de l’hémocytomètre.
4. Suspendre 2 x 10^{6 cellules} 4T1-luc2 dans 40 μL de PBS froid (pH 7,4, 4 °C) dans le capot de culture tissulaire.
5. Mélanger la suspension cellulaire de 40 μL avec 360 μL du mélange de protéines gélatineuses dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL sur la glace dans le capot de culture tissulaire.
   REMARQUE: La concentration finale est de 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS: mélange de protéines gélatineuses). Pour le modèle orthotopique (pas de mastectomie), 1 x 10^4/20μL de la concentration finale a été utilisé, pour éviter d’atteindre les critères d’euthanasie (taille de la tumeur > 2 cm) dans les deux semaines.

2. Inoculation des cellules cancéreuses

1. Mettez les souris dans la chambre d’induction d’anesthésie avec 2-4% d’isoflurane et 0,2 L/min d’écoulement d’oxygène jusqu’à ce que les souris respirent calmement (2-3 min).
2. Saisir la souris et injecter 0,05 mg/kg de buprénorphine dans son épaule sous-cutanée.
3. Confirmer une anesthésie adéquate par l’absence de réaction à une pincée d’un outeil. Insérez le nez de la souris dans le trou du masque de souris, ce qui permet une anesthésie par inhalation avec 2-4% d’isoflurane et 2 L/min d’écoulement d’oxygène attaché à une unité de bidon de charbon de bois.
4. Retenez les membres de la souris à l’aide de ruban adhésif de laboratoire et stérilisez sa peau à l’aide de chlorhexidine, d’iode et de 75 % d’éthanol, à l’aide d’écouvillons de coton.
5. Faire une incision cutanée de 5 mm au milieu de la paroi thoracique antérieure en utilisant des ciseaux de microdissection stériles, soulever la peau du côté droit à côté de l’incision et détacher la peau de la paroi thoracique à l’aide des ciseaux, puis, inverser la peau pour exposer la bonne #2 coussin graisseux mammaire.
6. Injectez soigneusement 20 μL de suspension des cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue à insuline de 1 mL avec une aiguille de 28,5 G dans la graisse tampon sous vision directe à travers la plaie.
   REMARQUE: L’aiguille traverse la plaie, pas la peau. Gardez l’aiguille dans la garniture grasse pendant 5 s avant de la retirer, ce qui laisse le temps au mélange de protéines gélatineuses de se solidifier.
7. Fermer les incisions cutanées en cousant, à l’aide de sutures stériles 5-0 non absorbables.
8. Après la chirurgie, retournez les animaux dans une cage propre et surveillez-les jusqu’à ce qu’ils aient récupéré et se déplacent librement (après ~1-2 min). Si un animal ne semble pas en bonne santé dans les 24 heures de la chirurgie, administrer de la buprénorphine (0,2 mg/kg).
9. Retirer les sutures sous anesthésie (voir étape 2.1) 7 d après la chirurgie.