Automatisierte multimodale Stimulation und simultane neuronale Ableitung von mehreren kleinen Organismen

Calcium-Bildgebungsverfahren haben die nicht-invasive Aufzeichnung der neuronalen Dynamik in vivo in Echtzeit mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie und genetisch kodierten Calciumindikatoren, die in Zielzellen exprimiert werden, ermöglicht ^1,2,3. Diese Sensoren verwenden in der Regel ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), wie z. B. die GFP-Calmodulin-M13-Peptidfamilie (GCaMP), um die Fluoreszenzintensität bei neuronaler Aktivierung und erhöhten intrazellulären Kalziumspiegeln zu erhöhen. Die Kalzium-Bildgebung hat sich beim Fadenwurm C. elegans als besonders leistungsfähig erwiesen, um zu untersuchen, wie Neuronen und neuronale Schaltkreise in lebenden, sich verhaltenden Tieren funktionieren 4,5,6,7,8,9,10, da ihre transparente Natur bedeutet^, dass kein chirurgischer Prozess für den optischen Zugang erforderlich ist und zellspezifische Genpromotoren die Expression auf die interessierenden Zellen abzielen. Bei diesen Techniken kommen häufig mikrofluidische Geräte zum Einsatz, die präzise kontrollierte Umgebungen bieten, um biologische, chemische und physikalische Phänomene auf kleinem physikalischen Maßstab zu untersuchen^11,12. Mikrofluidische Geräte zur Messung der neuronalen Aktivität gibt es in Hülle und Fülle, wobei ständig neue Designs entwickelt werden, und sie werden leicht im Forschungslabor hergestellt. Bei vielen Konstruktionen wird jedoch jeweils ein einzelnes Tier gefangen, was den experimentellen Durchsatz begrenzt ^7,9,13. Neuronale Reaktionen variieren oft erheblich zwischen den Tieren, was auf Unterschiede in früheren Erfahrungen, inneren Zuständen wie Stress oder Hunger oder stochastischen Faktoren wie der Genexpression zurückzuführen ist. Diese Unterschiede begründen den Bedarf an Methoden, die gleichzeitig viele Tiere stimulieren und beobachten und Informationen von Individuen extrahieren können⁴.

Darüber hinaus zeigen sich bestimmte neuromodulatorische Phänomene erst unter bestimmten Stimulationsbedingungen, wie z. B. die zeitliche Hemmung¹⁴, die sich auf die kurzzeitige Unterdrückung von Reaktionen bezieht, wenn die Stimulation in schneller Folge erfolgt. Elektrophysiologische Systeme können zu diesem Zweck die neuronale Aktivität über einen breiten Reizraum steuern, indem sie beispielsweise den elektrischen Impulsstrom, die Spannung, die Frequenz, die Wellenform, das Tastverhältnis und das Timing periodischer Reizzüge modulieren. Die indirekte Stimulation durch natürlich detektierte Reize oder optogenetische Systeme würde von einer ähnlichen Bandbreite an Kontrollmechanismen profitieren. Gegenwärtig werden viele natürliche Reize auf einfache “On-Off”-Weise präsentiert, wie z. B. die Geruchspräsentation und -entfernung, wobei kommerzielle Systeme verwendet werden, die nur langsam Flexibilität bieten. Kostengünstige Mikrocontroller können nun jedoch die Abgabe verschiedener Arten von Stimuli auf eine Weise automatisieren, die an die Bedürfnisse der Forscher angepasst werden kann. In Kombination mit der Mikrofluidik haben diese Systeme das Ziel erreicht, den experimentellen Durchsatz und die Flexibilität zu erhöhen, so dass neuronale Reaktionen auf eine Vielzahl präziser Reize bei vielen Tieren gleichzeitig gemessen werden können ^4,6. Die multimodale Stimulation kann verwendet werden, um die neuronalen Schaltkreise weiter abzufragen, z. B. durch die Überwachung von Veränderungen der neuronalen Erregbarkeit bei konsistenter Stimulation vor, während und nach einer orthogonalen Störung, wie z. B. einer Arzneimittelexposition⁴. Die Vorteile kostengünstiger, offener Mikroskopiesysteme liegen auf der Hand, um die wissenschaftliche Forschung voranzutreiben, doch in der Praxis kann die Notwendigkeit der Beschaffung, Konstruktion und Leistungsvalidierung von Teilen die Einführung dieser Techniken behindern.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, einige dieser technischen Herausforderungen zu entschärfen. Während sich frühere Protokolle auf die Verwendung mikrofluidischer Vorrichtungen und die grundlegende Stimulation ^9,15,17 konzentriert haben, beschreiben wir hier die Konstruktion und Verwendung eines flexiblen, automatisierten, multimodalen Stimulusabgabesystems für die neuronale Bildgebung in C. elegans oder anderen kleinen Organismen unter Verwendung zuvor beschriebener mikrofluidischer Vorrichtungen⁴. Das Open-Source-System wird über einfache Textdateien programmiert, um die Experimente zu definieren, und das NeuroTracker-Datenanalyseprogramm extrahiert halbautomatisch die neuronalen Aktivitätsdaten aus den Mikroskopvideos. Wir demonstrieren dieses System anhand von Beispielen zur Beurteilung der zeitlichen Hemmung, Enthemmung und des Reizübersprechens mit Hilfe des chemosensorischen Neurons AWA, das als Reaktion auf verschiedene Lebensmittelgerüche oder als Reaktion auf Licht depolarisiert, wenn optogenetische lichtempfindliche Ionenkanäle exprimiert^{werden 5,6}.