Summary

Geautomatiseerde multimodale stimulatie en gelijktijdige neuronale opname van meerdere kleine organismen

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

We presenteren een methode voor de flexibele chemische en multimodale stimulatie en registratie van gelijktijdige neurale activiteit van veel Caenorhabditis elegans-wormen . Deze methode maakt gebruik van microfluïdica, open-source hardware en software en gecontroleerde geautomatiseerde gegevensanalyse om de meting van neuronale verschijnselen zoals aanpassing, temporele remming en stimulusoverspraak mogelijk te maken.

Abstract

Fluorescerende genetisch gecodeerde calciumindicatoren hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van neurale dynamica van het niveau van individuele neuronen tot hele hersencircuits. Neurale reacties kunnen echter variëren als gevolg van eerdere ervaring, interne toestanden of stochastische factoren, waardoor de behoefte aan methoden ontstaat die de neurale functie bij veel individuen tegelijk kunnen beoordelen. Terwijl de meeste opnametechnieken een enkel dier tegelijk onderzoeken, beschrijven we het gebruik van breedveldmicroscopie om neuronale opnames op te schalen naar tientallen Caenorhabditis elegans of andere organismen op submillimeterschaal tegelijk. Open-source hardware en software bieden grote flexibiliteit bij het programmeren van volledig geautomatiseerde experimenten die de intensiteit en timing van verschillende soorten stimulus regelen, waaronder chemische, optische, mechanische, thermische en elektromagnetische stimuli. In het bijzonder bieden microfluïdische stroomapparaten nauwkeurige, herhaalbare en kwantitatieve controle van chemosensorische stimuli met een tijdsresolutie van minder dan een seconde. De NeuroTracker semi-geautomatiseerde data-analysepijplijn extraheert vervolgens individuele en populatiebrede neurale reacties om functionele veranderingen in neurale prikkelbaarheid en dynamiek te ontdekken. Dit artikel presenteert voorbeelden van het meten van neuronale aanpassing, temporele remming en stimulus crosstalk. Deze technieken verhogen de precisie en herhaalbaarheid van stimulatie, maken de verkenning van populatievariabiliteit mogelijk en zijn generaliseerbaar naar andere dynamische fluorescerende signalen in kleine biosystemen van cellen en organoïden tot hele organismen en planten.

Introduction

Calciumbeeldvormingstechnieken hebben de niet-invasieve registratie van in vivo neurale dynamiek in realtime mogelijk gemaakt met behulp van fluorescentiemicroscopie en genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgedrukt in doelcellen 1,2,3. Deze sensoren gebruiken meestal een groen fluorescerend eiwit (GFP), zoals de GFP-calmodulin-M13 peptide (GCaMP) familie, om de fluorescentie-intensiteit te verhogen bij neuronale activering en verhoogde intracellulaire calciumspiegels. Calciumbeeldvorming is vooral krachtig geweest in de nematode C. elegans voor het onderzoeken hoe neuronen en neurale circuits functioneren in levende, zich gedragende dieren 4,5,6,7,8,9,10, omdat hun transparante aard betekent dat er geen chirurgisch proces nodig is voor optische toegang, en celspecifieke genpromotors richten zich op expressie naar de cellen van belang. Deze technieken maken vaak gebruik van microfluïdische apparaten, die nauwkeurig gecontroleerde omgevingen bieden om biologische, chemische en fysische verschijnselen op kleine fysieke schaal te bestuderen11,12. Microfluïdische apparaten zijn er in overvloed voor het meten van neurale activiteit, met nieuwe ontwerpen die voortdurend in ontwikkeling zijn, en ze worden gemakkelijk vervaardigd in het onderzoekslaboratorium. Veel ontwerpen vangen echter één dier tegelijk, waardoor de experimentele doorvoer 7,9,13 wordt beperkt. Neurale reacties variëren vaak aanzienlijk tussen dieren als gevolg van verschillen in eerdere ervaring, interne toestanden zoals stress of honger, of stochastische factoren zoals genexpressieniveaus. Deze verschillen creëren een behoefte aan methoden die tegelijkertijd veel dieren kunnen stimuleren en observeren en informatie van individuen kunnen extraheren4.

Bovendien worden bepaalde neuromodulerende verschijnselen alleen duidelijk onder specifieke stimulatieomstandigheden, zoals temporele remming14, die verwijst naar de korte onderdrukking van reacties wanneer stimulatie snel achter elkaar plaatsvindt. Elektrofysiologische systemen kunnen voor dit doel neurale activiteit over een brede stimulusruimte sturen, waarbij bijvoorbeeld de elektrische pulsstroom, spanning, frequentie, golfvorm, duty cycle en timing van periodieke stimulustreinen worden gemoduleerd. Indirecte stimulatie door natuurlijk gedetecteerde stimuli of optogenetische systemen zou baat hebben bij een vergelijkbare breedte van controlemechanismen. Momenteel worden veel natuurlijke stimuli gepresenteerd op een eenvoudige “aan-uit” manier, zoals geurpresentatie en -verwijdering, met behulp van commerciële systemen die traag zijn geweest om flexibiliteit toe te voegen. Goedkope microcontrollers kunnen nu echter de levering van verschillende soorten stimuli automatiseren op een manier die kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoekers. In combinatie met microfluïdica hebben deze systemen het doel bereikt van verhoogde experimentele doorvoer en flexibiliteit, waardoor neurale reacties op een verscheidenheid aan nauwkeurige stimuli tegelijkertijd kunnen worden gemeten bij veel dieren 4,6. Multimodale stimulatie kan worden gebruikt om het neuronale circuit verder te ondervragen, bijvoorbeeld door veranderingen in neurale prikkelbaarheid te volgen bij consistent stimuleren voor, tijdens en na een orthogonale verstoring zoals blootstelling aan geneesmiddelen4. De voordelen van goedkope, open microscopiesystemen zijn duidelijk voor het bevorderen van wetenschappelijk onderzoek, maar in de praktijk kan de behoefte aan onderdeelinkoop, constructie en prestatievalidatie de adoptie van deze technieken belemmeren.

Dit protocol is bedoeld om een aantal van deze technische uitdagingen te verlichten. Terwijl eerdere protocollen zich richtten op het gebruik van microfluïdische apparaten en basisstimulatie 9,15,17, beschrijven we hier de constructie en het gebruik van een flexibel, geautomatiseerd, multimodaal stimulusafgiftesysteem voor neurale beeldvorming in C. elegans of andere kleine organismen met behulp van eerder beschreven microfluïdische apparaten4. Het open-source systeem is geprogrammeerd via eenvoudige tekstbestanden om de experimenten te definiëren, en het NeuroTracker data-analyseprogramma extraheert semi-automatisch de neurale activiteitsgegevens uit de microscoopvideo’s. We demonstreren dit systeem met voorbeelden van het beoordelen van temporele remming, ontremming en stimulus crosstalk met behulp van het chemosensorische neuron AWA, dat depolariseert als reactie op verschillende voedselgeuren of als reactie op licht bij het tot expressie brengen van optogenetische lichtgevoelige ionkanalen 5,6.

Protocol

1. Neurale beeldvormingsapparatuur OPMERKING: Zie Lawler en Albrecht15 voor gedetailleerde instructies over het bouwen van het beeldvormings- en stimulatiesysteem, dat de timing van de microscoopverlichting, beeldacquisitie en stimulusafgifte regelt (figuur 1). Een goedkope Arduino Nano-stimulusregelaar bedient de vloeistofkleppen via digitale signalen naar een klepregelaar en regelt de optogenetische verlichting via analoge …

Representative Results

We presenteren verschillende voorbeelden van stimuluspatronen die verschillende neurale verschijnselen beoordelen, waaronder temporele remming, aanpassing en ontremming. Temporele remming is de kortstondige onderdrukking van een neurale respons op een tweede stimuluspresentatie die kort na de eerste presentatie optreedt14. Om dit fenomeen te testen, werden in een paarpulsexperiment acht patronen gepresenteerd die bestonden uit twee 1 s odorantpulsen gescheiden door een interval va…

Discussion

In dit protocol beschrijven we een open-access microscopiesysteem voor de beoordeling van neurale activiteitsverschijnselen met behulp van de temporeel nauwkeurige levering van verschillende stimuluspatronen. Het microfluïdische platform levert herhaalbare stimuli terwijl het tientallen dieren in het gezichtsveld van de microscoop houdt. Weinig commerciële microscopiesoftwarepakketten maken het eenvoudig programmeren van verschillende stimulustimingpatronen mogelijk, en degenen die dat wel doen, vereisen vaak de handma…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken Fox Avery voor het testen van deze protocollen en het beoordelen van het manuscript en Eric Hall voor programmeerhulp. Financiering voor de hierin gepresenteerde methoden werd gedeeltelijk verstrekt door de National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).

Materials

Bacterial strains
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione Sigma-Aldrich Cat# B85307 diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2 Sigma-Aldrich Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt Sigma-Aldrich Cat# F6377
Glass water repellant Rain-X Cat #800002250 glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2 Sigma-Aldrich Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar Genesee Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm) Tritech Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 Dow Chemical Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl Sigma-Aldrich Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) Gelest CAS# 78560-45-9 glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE Arduino https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager Micro-manager https://micro-manager.org/
Microscope control software Albrecht Lab https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software Albrecht Lab https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) Zeiss Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator Excelitas Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera Hamamatsu Cat #C11440-22CU
Arduino nano Arduino Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) Parker Cat #LQX12-3W24FF48-000 Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve Bio-Chem Valve Inc Cat #075P2-S432 Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve NResearch Cat #161P091 Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) Mightex Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller AutoMate Scientific Cat #01-18
Wires and connectors various See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000  Dremel Cat #F0134000AB Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation Dremel Cat #220-01
Diamond drill bit Dremel Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick VWR Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber) Ted Pella Cat #54468
Luer 3-way stopcock Cole-Parmer Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle VWR Cat #89134-100
Microfluidic device Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article N/A
Microfluidic device clamp Warner Instruments (or machine shop) P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID Cole-Parmer Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″ New England Small Tube Cat #NE-1027-12

Referenzen

  1. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
  2. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
  3. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  4. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
  5. Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
  6. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
  7. Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  8. Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
  9. Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
  10. Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
  11. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
  12. Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
  13. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  14. Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).
  15. Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
  16. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
  17. Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
  18. NeuroTracker. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
  19. NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
  22. Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
  23. Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
  24. Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
White, H., Kamara, V., Gorski, V., Busby, M., Albrecht, D. R. Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms. J. Vis. Exp. (193), e65042, doi:10.3791/65042 (2023).

View Video