We presenteren een methode voor de flexibele chemische en multimodale stimulatie en registratie van gelijktijdige neurale activiteit van veel Caenorhabditis elegans-wormen . Deze methode maakt gebruik van microfluïdica, open-source hardware en software en gecontroleerde geautomatiseerde gegevensanalyse om de meting van neuronale verschijnselen zoals aanpassing, temporele remming en stimulusoverspraak mogelijk te maken.
Fluorescerende genetisch gecodeerde calciumindicatoren hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van neurale dynamica van het niveau van individuele neuronen tot hele hersencircuits. Neurale reacties kunnen echter variëren als gevolg van eerdere ervaring, interne toestanden of stochastische factoren, waardoor de behoefte aan methoden ontstaat die de neurale functie bij veel individuen tegelijk kunnen beoordelen. Terwijl de meeste opnametechnieken een enkel dier tegelijk onderzoeken, beschrijven we het gebruik van breedveldmicroscopie om neuronale opnames op te schalen naar tientallen Caenorhabditis elegans of andere organismen op submillimeterschaal tegelijk. Open-source hardware en software bieden grote flexibiliteit bij het programmeren van volledig geautomatiseerde experimenten die de intensiteit en timing van verschillende soorten stimulus regelen, waaronder chemische, optische, mechanische, thermische en elektromagnetische stimuli. In het bijzonder bieden microfluïdische stroomapparaten nauwkeurige, herhaalbare en kwantitatieve controle van chemosensorische stimuli met een tijdsresolutie van minder dan een seconde. De NeuroTracker semi-geautomatiseerde data-analysepijplijn extraheert vervolgens individuele en populatiebrede neurale reacties om functionele veranderingen in neurale prikkelbaarheid en dynamiek te ontdekken. Dit artikel presenteert voorbeelden van het meten van neuronale aanpassing, temporele remming en stimulus crosstalk. Deze technieken verhogen de precisie en herhaalbaarheid van stimulatie, maken de verkenning van populatievariabiliteit mogelijk en zijn generaliseerbaar naar andere dynamische fluorescerende signalen in kleine biosystemen van cellen en organoïden tot hele organismen en planten.
Calciumbeeldvormingstechnieken hebben de niet-invasieve registratie van in vivo neurale dynamiek in realtime mogelijk gemaakt met behulp van fluorescentiemicroscopie en genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgedrukt in doelcellen 1,2,3. Deze sensoren gebruiken meestal een groen fluorescerend eiwit (GFP), zoals de GFP-calmodulin-M13 peptide (GCaMP) familie, om de fluorescentie-intensiteit te verhogen bij neuronale activering en verhoogde intracellulaire calciumspiegels. Calciumbeeldvorming is vooral krachtig geweest in de nematode C. elegans voor het onderzoeken hoe neuronen en neurale circuits functioneren in levende, zich gedragende dieren 4,5,6,7,8,9,10, omdat hun transparante aard betekent dat er geen chirurgisch proces nodig is voor optische toegang, en celspecifieke genpromotors richten zich op expressie naar de cellen van belang. Deze technieken maken vaak gebruik van microfluïdische apparaten, die nauwkeurig gecontroleerde omgevingen bieden om biologische, chemische en fysische verschijnselen op kleine fysieke schaal te bestuderen11,12. Microfluïdische apparaten zijn er in overvloed voor het meten van neurale activiteit, met nieuwe ontwerpen die voortdurend in ontwikkeling zijn, en ze worden gemakkelijk vervaardigd in het onderzoekslaboratorium. Veel ontwerpen vangen echter één dier tegelijk, waardoor de experimentele doorvoer 7,9,13 wordt beperkt. Neurale reacties variëren vaak aanzienlijk tussen dieren als gevolg van verschillen in eerdere ervaring, interne toestanden zoals stress of honger, of stochastische factoren zoals genexpressieniveaus. Deze verschillen creëren een behoefte aan methoden die tegelijkertijd veel dieren kunnen stimuleren en observeren en informatie van individuen kunnen extraheren4.
Bovendien worden bepaalde neuromodulerende verschijnselen alleen duidelijk onder specifieke stimulatieomstandigheden, zoals temporele remming14, die verwijst naar de korte onderdrukking van reacties wanneer stimulatie snel achter elkaar plaatsvindt. Elektrofysiologische systemen kunnen voor dit doel neurale activiteit over een brede stimulusruimte sturen, waarbij bijvoorbeeld de elektrische pulsstroom, spanning, frequentie, golfvorm, duty cycle en timing van periodieke stimulustreinen worden gemoduleerd. Indirecte stimulatie door natuurlijk gedetecteerde stimuli of optogenetische systemen zou baat hebben bij een vergelijkbare breedte van controlemechanismen. Momenteel worden veel natuurlijke stimuli gepresenteerd op een eenvoudige “aan-uit” manier, zoals geurpresentatie en -verwijdering, met behulp van commerciële systemen die traag zijn geweest om flexibiliteit toe te voegen. Goedkope microcontrollers kunnen nu echter de levering van verschillende soorten stimuli automatiseren op een manier die kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoekers. In combinatie met microfluïdica hebben deze systemen het doel bereikt van verhoogde experimentele doorvoer en flexibiliteit, waardoor neurale reacties op een verscheidenheid aan nauwkeurige stimuli tegelijkertijd kunnen worden gemeten bij veel dieren 4,6. Multimodale stimulatie kan worden gebruikt om het neuronale circuit verder te ondervragen, bijvoorbeeld door veranderingen in neurale prikkelbaarheid te volgen bij consistent stimuleren voor, tijdens en na een orthogonale verstoring zoals blootstelling aan geneesmiddelen4. De voordelen van goedkope, open microscopiesystemen zijn duidelijk voor het bevorderen van wetenschappelijk onderzoek, maar in de praktijk kan de behoefte aan onderdeelinkoop, constructie en prestatievalidatie de adoptie van deze technieken belemmeren.
Dit protocol is bedoeld om een aantal van deze technische uitdagingen te verlichten. Terwijl eerdere protocollen zich richtten op het gebruik van microfluïdische apparaten en basisstimulatie 9,15,17, beschrijven we hier de constructie en het gebruik van een flexibel, geautomatiseerd, multimodaal stimulusafgiftesysteem voor neurale beeldvorming in C. elegans of andere kleine organismen met behulp van eerder beschreven microfluïdische apparaten4. Het open-source systeem is geprogrammeerd via eenvoudige tekstbestanden om de experimenten te definiëren, en het NeuroTracker data-analyseprogramma extraheert semi-automatisch de neurale activiteitsgegevens uit de microscoopvideo’s. We demonstreren dit systeem met voorbeelden van het beoordelen van temporele remming, ontremming en stimulus crosstalk met behulp van het chemosensorische neuron AWA, dat depolariseert als reactie op verschillende voedselgeuren of als reactie op licht bij het tot expressie brengen van optogenetische lichtgevoelige ionkanalen 5,6.
In dit protocol beschrijven we een open-access microscopiesysteem voor de beoordeling van neurale activiteitsverschijnselen met behulp van de temporeel nauwkeurige levering van verschillende stimuluspatronen. Het microfluïdische platform levert herhaalbare stimuli terwijl het tientallen dieren in het gezichtsveld van de microscoop houdt. Weinig commerciële microscopiesoftwarepakketten maken het eenvoudig programmeren van verschillende stimulustimingpatronen mogelijk, en degenen die dat wel doen, vereisen vaak de handma…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Fox Avery voor het testen van deze protocollen en het beoordelen van het manuscript en Eric Hall voor programmeerhulp. Financiering voor de hierin gepresenteerde methoden werd gedeeltelijk verstrekt door de National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).
Bacterial strains | |||
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
Experimental models: Organisms/strains | |||
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
Software and algorithms | |||
Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
Automated Microscope and Stimulation System | |||
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
Microfluidic Device Preparation | |||
Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |