Nöromelanin Granüllerinin Proteomik Profilinin LC-MS/MS Analizi için Lazer Mikrodiseksiyon Tabanlı Protokol
Summary
Burada, nöromelanin granüllerinin lazer mikrodiseksiyonu yoluyla insan post-mortem substantia nigra pars compacta dokusundan izole edilmesi için sağlam bir protokol sunulmuştur. Bu revize edilmiş ve optimize edilmiş protokol, numune toplama için gereken süreyi büyük ölçüde en aza indirir, gerekli numune miktarını azaltır ve LC-MS / MS analizi ile proteinlerin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini geliştirir.
Abstract
Nöromelanin, substantia nigra pars compacta’nın dopaminerjik nöronlarında nöromelanin granüllerinde (NMG’ler) bulunan siyah-kahverengimsi bir pigmenttir. Nöromelaninin yanı sıra, NMG’ler çeşitli proteinler, lipitler ve metaller içerir. NMG’leri içeren dopaminerjik nöronlar, Parkinson hastalığı ve Lewy cisimcikli demans gibi nörodejeneratif hastalıklarda tercihen kaybolmasına rağmen, NMG oluşumunun mekanizması ve NMG’lerin sağlık ve hastalıktaki rolü hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu nedenle, NMG’lerin moleküler karakterizasyonu hakkında daha fazla araştırma yapılması esastır. Ne yazık ki, proteinlerin izolasyonu için standart protokoller yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemeye dayanır ve bu nedenle yüksek miktarda insan dokusu gerektirir. Bu nedenle, burada NMG’lerin ve çevresindeki substantia nigra (SN) dokusunun tarafsız ve otomatik bir şekilde minimum miktarda doku kullanılarak toplanmasını sağlayan otomatik bir lazer mikrodiseksiyon (LMD) tabanlı protokol oluşturulmuştur. Eksize edilen numuneler daha sonra proteomik bileşimlerini deşifre etmek için kütle spektrometresi ile analiz edilir. Bu iş akışıyla, 514 proteini yalnızca NMG’lerde ve 181’i SN’de tanımlanan 2.079 protein tanımlandı. Mevcut sonuçlar, her iki proteom için% 87.6’lık bir örtüşmeye ulaşan benzer bir LMD tabanlı yaklaşım kullanılarak önceki bir çalışma ile karşılaştırılmış ve burada sunulan revize edilmiş ve optimize edilmiş protokolün uygulanabilirliğini doğrulamıştır. Mevcut bulguları doğrulamak için, ilgili proteinler hedeflenen kütle spektrometrisi, örneğin paralel reaksiyon izleme (PRM) deneyleri ile analiz edildi.
Introduction
Her doku, farklı hücre tiplerinin heterojen bir karışımından oluşur, ancak bir hücre tipinin spesifik izolasyonu genellikle daha kesin bir karakterizasyon için vazgeçilmezdir. Bir mikroskobu lazer uygulamasıyla birleştiren lazer mikrodiseksiyonu (LMD), doku alanlarının, tek hücrelerin veya hücresel alt yapıların karmaşık bir kompozitten spesifik izolasyonu için güçlü bir araçtır. LMD’nin kütle spektrometresi (LMD-MS) ile kombinasyon halinde uygulanması, DNA1, RNA2 ve proteinlerinizolasyonu 3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli araştırma soruları için başarıyla uygulanmıştır. Bu protokolde, Parkinson hastalığının yeni patomekanizmalarını deşifre etmek için insan post-mortem beyin dokusunun ve hücre altı bileşenlerin proteomik analizi için gözden geçirilmiş ve optimize edilmiş bir LMD-MS protokolü tanımlanmıştır.
Nöromelanin, substantia nigra pars compacta6’nın katekolaminerjik, dopamin üreten nöronlarında bulunan siyah, neredeyse çözünmeyen bir pigmenttir. Proteinler ve lipitlerle birlikte, nöromelanin granülleri (NMG’ler) 7,8,9 olarak adlandırılan çift zarla çevrili organel benzeri granüllerde birikir. NMG’ler, yaşlanma sürecinde10,11 oranında artan insanlarda üç yaşından itibaren gözlenebilir. Bugüne kadar, nöromelanin oluşumu hakkında kesin bir hipotez yoktur, ancak bir varsayım, nöromelaninin dopamin12’nin oksidasyonu yoluyla oluştuğudur. Diğer hipotezler, nöromelaninin enzimatik üretimine dayanmaktadır (örneğin, tirozinaz)13. Nöromelaninin kendisinin lipitlere, toksinlere, metal iyonlarına ve pestisitlere yüksek bağlanma afinitesine sahip olduğu bulunmuştur. Bu bulgulara dayanarak, NMG’lerin oluşumunun hücreyi toksik ve oksidatif maddelerin birikmesinden ve çevresel toksinlerden koruduğu varsayılmaktadır14,15. Bu nöroprotektif fonksiyonun yanı sıra, nöromelaninin nörodejeneratif etkilere neden olabileceğine dair kanıtlar vardır, örneğin demir doygunluğu ve ardından serbest radikallerin katalizi16,17. Ayrıca, nörodejeneratif süreçler sırasında salınan nöromelanin, daha önce nöromelanine bağlı reaktif metaller ve diğer toksik bileşikler tarafından nekrozu hızlandırabilen ve nöroinflamasyona ve hücresel hasara katkıda bulunabilen hidrojen peroksit tarafından ayrıştırılabilir18. Bununla birlikte, şimdiye kadar NMG’lerin Parkinson hastalığı sırasında olduğu gibi nörodejeneratif süreçlerdeki kesin rolü açıkça anlaşılamamıştır. Yine de, NMG’ler Parkinson hastalığının patogenezinde rol oynamaktadır ve spesifik analizleri nörodejenerasyondaki rollerini çözmek için son derece önemlidir. Ne yazık ki, yaygın laboratuvar hayvanları (örneğin, fareler ve sıçanlar) ve hücre hatları NMG’lerden yoksundur19. Bu nedenle, araştırmacılar analizleri için özellikle ölüm sonrası beyin dokusuna güvenmektedir. Geçmişte, yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile NMG izolasyonu, yüksek miktarda substantia nigra dokusunun mevcudiyetine dayanıyordu20,21. Günümüzde LMD, NMG’leri insan beyni örneklerinden özel olarak izole etmek ve daha sonra LC-MS / MS ile analiz etmek için çok yönlü bir araç sunmaktadır.
Bu protokolde, NMG’lerin ve çevresindeki dokunun (SN) izolasyonu için önceki bir protokol22’nin geliştirilmiş ve otomatikleştirilmiş bir versiyonu sunularak daha hızlı bir numune üretimi, daha fazla sayıda tanımlanmış ve nicelleştirilmiş protein ve gerekli doku miktarlarının ciddi şekilde azaltılması sağlanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
LMD, spesifik doku alanlarının, tek hücrelerin veya hücre altı yapıların izolasyonu için yaygın olarak uygulanan bir tekniktir. Burada sunulan revize edilmiş ve otomatik protokolde, bu teknik nöromelanin granüllerinin (NMG’ler) ve NMG’yi çevreleyen dokunun (SN) spesifik izolasyonu için uygulanır. Şimdiye kadar, NMG’lerin insan post-mortem beyin dokusundan izole edilmesi için iki farklı yaklaşım yayınlanmış ve yaygın olarak kullanılmıştır:
a) 1 g substan…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma de tarafından desteklenmiştir. NBI, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı’nın (BMBF) (hibe numarası FKZ 031 A 534A) ve P.U.R.E. (Avrupa Protein Araştırma Birimi Ruhr) ve Protein Teşhis Merkezi’nin (ProDi) bir projesi, her ikisi de Almanya’nın Kuzey-Ren Vestfalya eyaletindeki Yenilik, Bilim ve Araştırma Bakanlığı’ndan hibe alıyor.
Materials
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
Referenzen
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -. K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson’s disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson’s disease. NPJ Parkinson’s Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- . Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn’s diagrams Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007)
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
