פרוטוקול מבוסס מיקרודיסקציה בלייזר לניתוח LC-MS/MS של הפרופיל הפרוטאומי של גרגירי נוירומלנין

כל רקמה מורכבת מתערובת הטרוגנית של סוגי תאים שונים, אך הבידוד הספציפי של סוג תא אחד הוא לעתים קרובות הכרחי לאפיון מדויק יותר. מיקרודיסקציית לייזר (LMD), צימוד מיקרוסקופ עם יישום לייזר, היא כלי רב עוצמה לבידוד ספציפי של אזורי רקמות, תאים בודדים או תת-מבנים תאיים מתוך קומפלקס מורכב. היישום של LMD בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (LMD-MS) כבר יושם בהצלחה עבור מספר שאלות מחקר, כולל בידוד של DNA¹, RNA² וחלבונים 3,4,5. בפרוטוקול זה מתואר פרוטוקול LMD-MS מתוקן וממוטב לניתוח פרוטאומי של רקמת מוח אנושית לאחר המוות ורכיבים תת-תאיים לפענוח פתומכניזמים חדשים של מחלת פרקינסון.

נוירומלנין הוא פיגמנט שחור, כמעט בלתי מסיס, המצוי בתאי העצב הקטכולמינרגיים, המייצרים דופמין, של ה-substantia nigra pars compacta⁶. יחד עם חלבונים ושומנים, הוא מצטבר בגרגירים דמויי אברונים המוקפים בקרום כפול, הנקרא גרגירי נוירומלנין (NMGs)^7,8,9. NMGs ניתן לראות מגיל שלוש שנים בבני אדם עולה בכמות ובצפיפות במהלך תהליך ההזדקנות^10,11. נכון להיום, אין השערה ברורה על היווצרות נוירומלנין, אבל הנחה אחת היא כי neuromelanin נוצר באמצעות חמצון של דופמין¹². השערות אחרות מבוססות על ייצור אנזימטי של נוירומלנין (למשל, טירוזינאז)¹³. נוירומלנין עצמו נמצא כבעל זיקה גבוהה לשומנים, רעלנים, יוני מתכת וחומרי הדברה. בהתבסס על ממצאים אלה, ההנחה היא כי היווצרות NMGs מגינה על התא מפני הצטברות של חומרים רעילים וחמצוניים ומפני רעלנים סביבתיים^14,15. מלבד פונקציה זו של הגנה על מערכת העצבים, קיימות עדויות לכך שנוירומלנין עשוי לגרום להשפעות ניווניות של מערכת העצבים, למשל על ידי רוויית ברזל ובעקבות זאת קטליזה של רדיקלים חופשיים^16,17. יתר על כן, נוירומלנין המשתחרר במהלך תהליכים נוירודגנרטיביים יכול להתפרק על ידי מי חמצן, אשר יכול להאיץ נמק על ידי מתכות תגובתיות ותרכובות רעילות אחרות שנקשרו בעבר לנוירומלנין ועשוי לתרום לדלקת עצבית ולנזק תאי¹⁸. עם זאת, עד כה את התפקיד המדויק של NMGs בתהליכים נוירודגנרטיביים כמו במהלך מחלת פרקינסון אינו מובן בבירור. ובכל זאת, נראה כי NMGs מעורבים בפתוגנזה של מחלת פרקינסון והניתוח הספציפי שלהם הוא בעל חשיבות עליונה כדי לפענח את תפקידם בניוון עצבי. למרבה הצער, חיות מעבדה נפוצות (למשל, עכברים וחולדות) וקווי תאים חסרים NMGs¹⁹. לכן, חוקרים מסתמכים במיוחד על רקמת מוח לאחר המוות לצורך הניתוח שלהם. בעבר, בידוד NMG על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות הסתמך על הזמינות של כמויות גבוהות של רקמת סובסטנטיה ניגרה ^20,21. כיום, LMD מציג כלי רב-תכליתי לבידוד ספציפי של NMGs מדגימות מוח אנושיות כדי לנתח אותם על ידי LC-MS/MS.

בפרוטוקול זה מוצגת גרסה משופרת ואוטומטית של פרוטוקול²² הקודם לבידוד NMGs והרקמות הסובבות אותם (SN), מה שמאפשר יצירת דגימה מהירה יותר, מספר גבוה יותר של חלבונים מזוהים ומכמתים, והפחתה חמורה של כמויות הרקמות הנדרשות.