ニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS/MS分析のためのレーザーマイクロダイセクションベースのプロトコル

すべての組織は、異なる細胞タイプの不均一な混合物で構成されていますが、より正確な特性評価には、多くの場合、1つの細胞タイプの特異的分離が不可欠です。顕微鏡とレーザーアプリケーションを組み合わせたレーザーマイクロダイセクション(LMD)は、複雑な複合材料から組織領域、単一細胞、または細胞下部構造を特異的に分離するための強力なツールです。質量分析(LMD-MS)と組み合わせたLMDの適用は、DNA¹、RNA²、タンパク質^3,4,5の単離を含むいくつかの研究課題に対してすでに成功裏に実施されています。このプロトコルでは、パーキンソン病の新しい病態メカニズムを解読するために、ヒトの死後脳組織および細胞内成分のプロテオミクス分析のために、改訂および最適化されたLMD-MSプロトコルが説明されています。

ニューロメラニンは、黒質コンパクタ⁶のカテコールアミン作動性のドーパミン産生ニューロンに見られる黒色のほぼ不溶性の色素です。タンパク質や脂質とともに、ニューロメラニン顆粒(NMG)と呼ばれる二重膜に囲まれたオルガネラ様顆粒に蓄積します^7,8,9。NMGは、老化プロセス中に量と密度が増加するヒトの3歳から観察することができます^10,11。今日まで、ニューロメラニン形成に関する明確な仮説はありませんが、1つの仮定は、ニューロメラニンがドーパミン¹²の酸化によって形成されるというものです。他の仮説は、ニューロメラニン(例えば、チロシナーゼ)の酵素的産生に基づいている¹³。ニューロメラニン自体は、脂質、毒素、金属イオン、農薬に対して高い結合親和性を有することが判明した。これらの知見に基づいて、NMGの形成は、有毒および酸化性物質の蓄積および環境毒素から細胞を保護すると仮定されている^14,15。この神経保護機能に加えて、ニューロメラニンが、例えば、鉄飽和およびそれに続くフリーラジカルの触媒作用によって、神経変性作用を引き起こす可能性があるという証拠がある^16,17。さらに、神経変性プロセス中に放出されるニューロメラニンは過酸化水素によって分解される可能性があり、これは以前にニューロメラニンに結合していた反応性金属および他の毒性化合物による壊死を加速し、神経炎症および細胞損傷に寄与する可能性がある¹⁸。しかし、これまで、パーキンソン病の経過のような神経変性過程におけるNMGの正確な役割は明確に理解されていません。それでも、NMGはパーキンソン病の病因に関与しているようであり、神経変性におけるNMGの役割を解明するには、NMGの特定の分析が最も重要です。残念なことに、一般的な実験動物(例えば、マウスおよびラット)および細胞株はNMGを欠いている¹⁹。したがって、研究者は特に分析のために死後の脳組織に依存しています。過去には、密度勾配遠心分離によるNMG単離は、大量の黒質組織の利用可能性に依存していました^20,21。今日、LMDは、ヒトの脳サンプルからNMGを特異的に分離し、LC-MS/MSで分析するための汎用性の高いツールを提供しています。

このプロトコルでは、NMGおよび周辺組織(SN)の単離のために、以前のプロトコル²² の改良および自動化バージョンが提示され、より速いサンプル生成、より多くの同定および定量されたタンパク質、および必要な組織量の大幅な削減を可能にする。