基于激光显微切割的协议，用于神经黑色素颗粒蛋白质组学谱的LC-MS / MS分析
Summary
这里提出了一个强大的方案，用于通过激光显微切割从人死后黑质致密组织中分离神经黑色素颗粒。该修订和优化的方案大大减少了样品采集所需的时间，减少了所需的样品量，并通过LC-MS/MS分析增强了蛋白质的鉴定和定量。
Abstract
神经黑色素是一种黑褐色色素，存在于 黑质致密的多巴胺能神经元中的所谓神经黑色素颗粒（NMG）中。除了神经黑色素，NMG 还含有多种蛋白质、脂质和金属。尽管含有NMG的多巴胺能神经元在帕金森病和路易体痴呆等神经退行性疾病中优先丢失，但对NMG形成的机制以及NMG在健康和疾病中的作用知之甚少。因此，进一步研究NMG的分子表征至关重要。不幸的是，蛋白质分离的标准方案基于密度梯度超速离心，因此需要大量的人体组织。因此，这里建立了一个基于自动激光显微切割（LMD）的协议，该协议允许以无偏，自动化的方式使用最少量的组织收集NMG和周围的 黑质 （SN）组织。随后通过质谱分析切除的样品以破译其蛋白质组组成。通过该工作流程，鉴定了 2，079 种蛋白质，其中 514 种蛋白质在 NMG 中独家鉴定，181 种在 SN 中鉴定。目前的结果已与先前使用类似基于LMD的方法的研究进行了比较，两种蛋白质组的重叠率为87.6%，验证了此处介绍的修订和优化方案的适用性。为了验证目前的发现，通过靶向质谱分析感兴趣的蛋白质，例如平行反应监测（PRM）实验。
Introduction
每个组织都由不同细胞类型的异质混合物组成，但一种细胞类型的特异性分离对于更精确的表征通常是必不可少的。激光显微切割（LMD）将显微镜与激光应用相结合，是一种强大的工具，用于从复杂的复合材料中特异性分离组织区域、单细胞或细胞亚结构。LMD与质谱（LMD-MS）相结合的应用已经成功地应用于多个研究问题，包括DNA1，RNA2和蛋白质3，4，5的分离。在该协议中，描述了修订和优化的LMD-MS协议，用于人类死后脑组织和亚细胞成分的蛋白质组学分析，以破译帕金森病的新病理机制。
神经黑色素是一种黑色、几乎不溶性的色素，存在于黑质致密6的儿茶酚胺能、产生多巴胺的神经元中。它与蛋白质和脂质一起积聚在被双层膜包围的细胞器样颗粒中，称为神经黑色素颗粒（NMG）7，8，9。从三岁开始，可以观察到人类的NMG在衰老过程中数量和密度增加10，11。迄今为止，关于神经黑色素的形成还没有明确的假设，但一种假设是神经黑色素是通过多巴胺12的氧化形成的。其他假设基于神经黑色素（例如酪氨酸酶）的酶促产生13。发现神经黑色素本身对脂质、毒素、金属离子和杀虫剂具有高结合亲和力。基于这些发现，假设NMG的形成可以保护细胞免受有毒和氧化物质以及环境毒素的积累14，15。除了这种神经保护功能外，有证据表明神经黑色素可能引起神经退行性作用，例如，通过铁饱和和随后的自由基催化16，17。此外，在神经退行性过程中释放的神经黑色素可以被过氧化氢分解，这可能会加速先前与神经黑色素结合的活性金属和其他有毒化合物的坏死，并可能导致神经炎症和细胞损伤18。然而，到目前为止，NMG在帕金森病过程中的神经退行性过程中的确切作用尚不清楚。尽管如此，NMG似乎参与了帕金森病的发病机制，它们的具体分析对于揭示它们在神经变性中的作用至关重要。不幸的是，常见的实验动物（例如，小鼠和大鼠）和细胞系缺乏NMG19。因此，研究人员特别依赖死后脑组织进行分析。过去，通过密度梯度离心分离NMG依赖于大量黑质组织的可用性20，21。如今，LMD提供了一种多功能工具，可以从人脑样本中特异性分离NMG，然后通过LC-MS / MS进行分析。
在该协议中，提出了先前方案22 的改进和自动化版本，用于分离NMG和周围组织（SN），从而实现更快的样品生成，更多数量的鉴定和定量蛋白质，并严重减少所需的组织量。
Protocol
Representative Results
Discussion
LMD是一种广泛适用的技术，用于分离特定组织区域，单细胞或亚细胞结构。在这里介绍的修订和自动化方案中，该技术应用于神经黑色素颗粒（NMG）和NMG周围组织（SN）的特异性分离。到目前为止，已经发表了两种从人类 死后 脑组织中分离NMG的不同方法并被广泛使用：
a） 消耗 1 g 黑质 组织的不连续蔗糖梯度20.由于人类 死后黑质 组织很…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了德的支持。NBI，德国联邦教育和研究部（BMBF）（批准号FKZ 031 A 534A）和P.U.R.E.（欧洲鲁尔蛋白质研究单位）和蛋白质诊断中心（ProDi）资助的项目，均来自德国北莱茵-威斯特法伦州创新，科学和研究部。
Materials
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
Referenzen
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -. K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson’s disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson’s disease. NPJ Parkinson’s Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- . Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn’s diagrams Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007)
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
