Protocole basé sur la microdissection laser pour l’analyse LC-MS/MS du profil protéomique des granules de neuromélanine
Summary
Un protocole robuste est présenté ici pour isoler les granules de neuromélanine à partir de tissu humain post-mortem substantia nigra pars compacta par microdissection laser. Ce protocole révisé et optimisé minimise considérablement le temps requis pour le prélèvement des échantillons, réduit la quantité d’échantillon requise et améliore l’identification et la quantification des protéines par analyse LC-MS/MS.
Abstract
La neuromélanine est un pigment noir-brunâtre, présent dans les granules de neuromélanine (NMG) dans les neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta. Outre la neuromélanine, les NMG contiennent une variété de protéines, de lipides et de métaux. Bien que les neurones dopaminergiques contenant des NMG soient préférentiellement perdus dans les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et la démence à corps de Lewy, on ne sait que peu de choses sur le mécanisme de formation des NMG et le rôle des NMG dans la santé et la maladie. Il est donc essentiel de poursuivre les recherches sur la caractérisation moléculaire des NMG. Malheureusement, les protocoles standard pour l’isolement des protéines sont basés sur l’ultracentrifugation à gradient de densité et nécessitent donc de grandes quantités de tissu humain. Ainsi, un protocole automatisé basé sur la microdissection laser (LMD) est établi ici qui permet la collecte de NMG et de tissus substantiels environnants (SN) en utilisant des quantités minimales de tissu de manière impartiale et automatisée. Les échantillons excisés sont ensuite analysés par spectrométrie de masse pour déchiffrer leur composition protéomique. Avec ce flux de travail, 2 079 protéines ont été identifiées, dont 514 protéines ont été identifiées exclusivement dans les NMG et 181 dans SN. Les résultats actuels ont été comparés à une étude précédente utilisant une approche similaire basée sur le LMD atteignant un chevauchement de 87,6% pour les deux protéomes, vérifiant l’applicabilité du protocole révisé et optimisé présenté ici. Pour valider les résultats actuels, les protéines d’intérêt ont été analysées par spectrométrie de masse ciblée, par exemple des expériences de surveillance des réactions parallèles (PRM).
Introduction
Chaque tissu est constitué d’un mélange hétérogène de différents types de cellules, mais l’isolement spécifique d’un type de cellule est souvent indispensable pour une caractérisation plus précise. La microdissection laser (LMD), qui associe un microscope à une application laser, est un outil puissant pour l’isolation spécifique de zones tissulaires, de cellules individuelles ou de sous-structures cellulaires à partir d’un composite complexe. L’application du LMD en combinaison avec la spectrométrie de masse (LMD-MS) a déjà été mise en œuvre avec succès pour plusieurs questions de recherche, notamment l’isolement de l’ADN1, de l’ARN2 et des protéines 3,4,5. Dans ce protocole, un protocole LMD-MS révisé et optimisé est décrit pour l’analyse protéomique du tissu cérébral humain post-mortem et des composants sous-cellulaires afin de déchiffrer les nouveaux mécanismes pathologiques de la maladie de Parkinson.
La neuromélanine est un pigment noir, presque insoluble, trouvé dans les neurones catécholaminergiques producteurs de dopamine de la substance noire pars compacta6. Avec les protéines et les lipides, il s’accumule en granules ressemblant à des organites entourés d’une double membrane, appelés granules de neuromélanine (NMG)7,8,9. Les NMG peuvent être observés dès l’âge de trois ans chez l’homme augmentant en quantité et en densité au cours du processus de vieillissement10,11. À ce jour, il n’y a pas d’hypothèse définie sur la formation de neuromélanine, mais une hypothèse est que la neuromélanine est formée par l’oxydation de la dopamine12. D’autres hypothèses sont basées sur la production enzymatique de neuromélanine (par exemple, tyrosinase)13. La neuromélanine elle-même s’est avérée avoir une forte affinité de liaison aux lipides, aux toxines, aux ions métalliques et aux pesticides. Sur la base de ces résultats, la formation de NMG est supposée protéger la cellule de l’accumulation de substances toxiques et oxydatives et des toxines environnementales14,15. Outre cette fonction neuroprotectrice, il existe des preuves que la neuromélanine peut provoquer des effets neurodégénératifs, par exemple par saturation en fer et la catalyse ultérieure des radicaux libres16,17. De plus, la neuromélanine libérée au cours des processus neurodégénératifs peut être décomposée par le peroxyde d’hydrogène, ce qui pourrait accélérer la nécrose par les métaux réactifs et d’autres composés toxiques précédemment liés à la neuromélanine et peut contribuer à la neuroinflammation et aux dommages cellulaires18. Cependant, jusqu’à présent, le rôle exact des NMG dans les processus neurodégénératifs comme dans l’évolution de la maladie de Parkinson n’est pas clairement compris. Pourtant, les NMG semblent être impliqués dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson et leur analyse spécifique est de la plus haute importance pour démêler leur rôle dans la neurodégénérescence. Malheureusement, les animaux de laboratoire courants (p. ex. souris et rats) et les lignées cellulaires n’ont pas de NMG19. Par conséquent, les chercheurs s’appuient particulièrement sur le tissu cérébral post-mortem pour leur analyse. Dans le passé, l’isolement des NMG par centrifugation par gradient de densité reposait sur la disponibilité de grandes quantités de tissu substantiel nigra 20,21. Aujourd’hui, LMD présente un outil polyvalent pour isoler spécifiquement les NMG à partir d’échantillons de cerveau humain afin de les analyser ensuite par LC-MS/MS.
Dans ce protocole, une version améliorée et automatisée d’un protocole précédent22 est présentée pour l’isolement des NMG et des tissus environnants (SN), permettant une génération d’échantillons plus rapide, un nombre plus élevé de protéines identifiées et quantifiées et une réduction sévère des quantités tissulaires requises.
Protocol
Representative Results
Discussion
La LMD est une technique largement applicable pour l’isolement de zones tissulaires spécifiques, de cellules uniques ou de structures subcellulaires. Dans le protocole révisé et automatisé présenté ici, cette technique est appliquée pour l’isolement spécifique des granules de neuromélanine (NMG) et des tissus environnants (SN) NMG. Jusqu’à présent, deux approches différentes pour l’isolement des NMG hors du tissu cérébral humain post-mortem ont été publiées et largement utilisées:
<…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par de. NBI, un projet du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche (BMBF) (numéro de subvention FKZ 031 A 534A) et P.U.R.E. (Protein Research Unit Ruhr within Europe) et Center for Protein Diagnostics (ProDi), tous deux du ministère de l’Innovation, de la Science et de la Recherche de Rhénanie-du-Nord-Westphalie, Allemagne.
Materials
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
Referenzen
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -. K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson’s disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson’s disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson’s disease. NPJ Parkinson’s Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- . Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn’s diagrams Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007)
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
