FLAG-ビオチンタンデム精製による架橋と免疫沈降によるタンパク質RNA相互作用のトランスクリプトーム全体プロファイリング
Summary
ここでは、哺乳類細胞におけるRNA結合タンパク質(RRB)のRNA標的を決定するために、フラグビオチンタンデム精製を用いて 、FbioCLIP-seqと呼ばれる改変CLIP-seqプロトコルを提示する。
Abstract
RNAおよびRNA結合タンパク質(RRP)は、複数の生物学的プロセスを制御します。RNAとRRPの空間的および時間的な配置は、これらのプロセスの繊細な規制の根底にある。CLIP-seq(架橋と免疫沈降)と呼ばれる戦略は、内因性タンパク質とRNAの相互作用をUV架橋と免疫沈降と捉え、免疫沈降を伴って開発されました。RBP研究では従来のCLIP-seq法が広く使用されているにもかかわらず、CLIP法は、高品質の抗体の入手可能性、精製されたRBPからの潜在的な汚染物質、同位体操作の要件、および退屈な実験手順中の情報の潜在的な損失によって制限されています。ここでは、FLAG-ビオチンタグタンデム精製を用いた 、FbioCLIP-seqと呼ばれる改変CLIP-seq法について説明します。タンデム精製と厳しい洗浄条件により、相互作用するRNA結合タンパク質のほとんどすべてが除去されます。したがって、これらの共精製されたRRPによって間接的に媒介されるRNAも減少する。当社 のFbioCLIP-seq法は、同位体を含まない、タンパク質特異的抗体フリーの方法で、SDS-PAGEおよび膜移動手順を伴わない直接タンパク質結合RNAを効率的に検出することを可能にします。
Introduction
RNAおよびRNA結合タンパク質(RRP)は、スプライシング、翻訳、リボソーム生物形成、エピジェネティック調節、および細胞運命遷移1、2、3、4、5、6を含む多様な細胞プロセスを制御する。これらのプロセスの繊細なメカニズムは、RNAとRRPのユニークな空間的および時間的配置に依存する。したがって、分子レベルでのRNA調節を理解するための重要なステップは、RRPの結合部位に関する位置情報を明らかにすることです。
架橋と免疫沈降(CLIP-seq)と呼ばれる戦略は、目的のタンパク質の免疫沈降に続いてUV架橋とタンパク質RNA相互作用を捕捉するために開発された。方法論の主な特徴は、UV照射によるRNA結合タンパク質とその直接結合RNA分子(〜1Å内)との間の共有結合架橋の誘導である。RBP フットプリントは、CLIP タグ クラスタリングとピーク コールによって決定できます。あるいは、CLIPの逆転写ステップは、単一ヌクレオチド分解能でRNA上のタンパク質結合部位を同定できる架橋部位へのインデル(挿入または欠失)または置換につながる可能性がある。Novoalign や CIMS のようなパイプラインは CLIP-seq8のハイスループットシーケンシング結果の分析のために開発されました。また、個別ヌクレオチド分解能架橋および免疫沈降(iCLIP)、強化CLIP(eCLIP)、および光活性化可能なリボヌクレオシド強化架橋および免疫沈降(PAR-CLIP)9、10、11、12を含むいくつかの改変CLIP-seq法も提案されている。
RRPの研究において従来のCLIP-seq法が広く使用されているにもかかわらず、CLIP法には幾つかの欠点がある。まず、退屈な変性ゲル電気泳動および膜移動手順は情報の損失を招き、限定的な配列の複雑さを引き起こす可能性がある。第二に、タンパク質特異的抗体ベースのCLIP法は、単一の標的タンパク質の代わりにタンパク質複合体を引き下げる可能性があり、これは、共精製されたRbPsからの偽陽性タンパク質とRNAの相互作用につながる可能性がある。第三に、抗体ベースの戦略は、高品質の抗体を使用しないRBPの研究のためにこれらの方法の適用が不十分な、高品質の抗体の研究には不十分である。第4に、従来のCLIP法では、タンパク質結合RNAに標識するために放射標識ATPが必要です。
ビオチン化タンパク質に対するストレプトアビジンの高い親和性は、特定のタンパク質またはタンパク質複合体を精製するための非常に強力なアプローチです。哺乳動物細胞において異所性に発現した細菌ビラビチンリガーゼによって人工ペプチド配列を運ぶタンパク質の効率的なビオチン化は、生体13でビオチン精製を行う効率的な戦略となる。我々は、FLAG-ビオチンタグタンデム精製14を用いて、FbioCLIP-seq(F LAG-バイオスズ媒介Cロス-lインクとImmunop再配列化に続いてハイスループットシーケンシング)と呼ばれる改変CLIP-seq法を開発した(図1)。タンデム精製と厳しい洗浄条件により、相互作用するRMPのほとんどすべてが除去される(図2)。厳しい洗浄条件はまた、SDS-PAGEと膜移動を回避することを可能にし、労働集約的で技術的に困難です。そして、eCLIPとirCLIPと同様に、FbioCLIP-seq法は同位体フリーです。ゲルの実行と転送ステップをスキップすると、情報の損失を回避し、本物のタンパク質とRNAの相互作用をそのまま維持し、ライブラリの複雑さを増します。さらに、タグ付けシステムの高効率は、高品質の抗体を利用できないRbPsにとって良い選択です。
ここでは、哺乳類細胞のFbioCLIP-seqプロトコルのステップバイステップの説明を提供します。簡単に言えば、細胞は254nm UVで架橋され、続いて細胞リシスおよびFLAG免疫沈降(FLAG-IP)が続く。次に、タンパク質RNA複合体は、ビオチン親和性捕捉によってさらに精製され、RNAはMNaseによる部分消化によって断片化される。次いで、タンパク質結合RNAを脱リン酸化し、3’リンカーで結紮する。5’RNAリンカーは、RNAがPNKでリン酸化され、プロテナーゼK消化によって溶出した後に添加されます。逆転写後、タンパク質結合RNAシグナルをPCRによって増幅し、アガロースゲル精製によって精製します。2つのRbPは、FbioCLIP-seqの結果を例示するために選ばれました。LIN28は、マイクロRNA成熟、タンパク質翻訳、および細胞リプログラミング15、16、17に関与するRNA結合タンパク質の特徴を有する。WDR43は、リボソームバイオジェネシス、真核転写、および胚性幹細胞多能性制御14,18を調整すると考えられているWD40ドメイン含有タンパク質である。CLIP-seqを用いたLIN28に関する以前に報告された結果と一致して、FbioCLIP-seqは、マイクロRNAミールレット7gおよびmRNA16、19の「GGAG」モチーフに関するLIN28の結合部位を明らかにする(図3)。WDR43 FbioCLIP-seqはまた、RRNA20の5′-ETSの外部転写スペーサー(5′-ETS)を有するWDR43の結合好みを同定した(図4)。これらの結果は、FbioCLIP-seq法の信頼性を検証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、FLAG-ビオチン二重タグ付けシステムを利用してタンパク質RNA複合体のタンデム精製を行う改変CLIP-seq法を紹介します。FLAG-ビオチン二重タグ付けシステムは、タンパク質とタンパク質とDNA相互作用を同定する上で強力であることが示されている13,21.ここでは、タンパク質と相互作用するRNAを同定する際のこのシステムの高い特異性…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
中国国立基礎研究プログラム(2017YFA0504204、2018YFA0107604)、中国国立自然科学財団(31630095)、清華大学生命科学センターからの支援を受けています。
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
Referenzen
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3′ Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
