Profilazione a livello di trascrizione delle interazioni proteina-RNA attraverso il cross-linking e l'immunoprecipitazione mediata dalla purificazione tandem FLAG-Biotina

Gli RNA e le proteine leganti l’RNA (RRP) controllano diversi processi cellulari tra cui splicing, traduzione, biogenesi ribosoma, regolazione epigenetica e transizione del destino^{cellulare 1,2,3,4,5,6}. I delicati meccanismi di questi processi dipendono dalla disposizione spaziale e temporale unica di RTA e RRP. Pertanto, un passo importante verso la comprensione della regolazione dell’RNA a livello molecolare è quello di rivelare le informazioni posizionali sui siti vincolanti degli RRP.

È stata sviluppata una strategia denominata cross-linking e immunoprecipitazione (CLIP-seq) per catturare le interazioni proteina-RNA con il cross-linking UV seguito dall’immunoprecipitazione della proteina di interesse⁷. La caratteristica chiave della metodologia è l’induzione di collegamenti incrociati covalenti tra una proteina legante l’RNA e le sue molecole di RNA direttamente legate (entro ~1 Å) dall’irradiazione UV⁸. Le impronte RBP possono essere determinate dal clustering di tag CLIP e dalle chiamate di picco, che di solito hanno una risoluzione di 30−60 nt. In alternativa, la fase di trascrizione inversa di CLIP può portare a indeli (inserimenti o deduzioni) o sostituzioni ai siti di collegamento incrociato, che consente l’identificazione di siti di legame proteico sugli RNA con una risoluzione mono nucleotidica. Condotte come Novoalign e CIMS sono state sviluppate per l’analisi dei risultati di sequenziamento ad alta produttività di CLIP-seq⁸. Sono stati proposti anche diversi metodi CLIP-seq modificati, tra cui il cross-linking e l’immunoprecipitazione della risoluzione del nucleotide individuale (iCLIP), CLIP avanzato (eCLIP), irCLIP e cross-linking e immunoprecipitazione fotoattivibili ribonucleoside (PAR-CLIP)^9,10,11,12.

Nonostante l’ampio uso dei metodi CLIP-seq tradizionali nello studio degli RRP, i metodi CLIP presentano diversi inconvenienti. In primo luogo, la noiosa elettroforesi del gel denaturato e la procedura di trasferimento a membrana possono portare alla perdita di informazioni e causare una complessità della sequenza limitata. In secondo luogo, il metodo CLIP specifico della proteina basato su anticorpi può abbattere un complesso proteico anziché una singola proteina bersaglio, il che può portare a false interazioni proteina-RNA positive dagli RRP copurificati. In terzo luogo, la strategia basata su anticorpi richiede una grande quantità di anticorpi di alta qualità, il che rende l’applicazione di questi metodi inadeguata per lo studio degli RRB senza anticorpi di alta qualità disponibili. In quarto luogo, il metodo TRADIZIONALE CLIP richiede ATP radioetichettato per etichettare gli RNA legati alle proteine.

L’alta affinità della streptavidina con le proteine biotinilate lo rende un approccio molto potente per purificare specifiche proteine o complessi proteici. L’efficiente biotinylazione delle proteine che trasportano una sequenza peptidica artificiale mediante la biotina ligasi bira etopica nelle cellule di mammifero lo rende una strategia efficiente per eseguire la purificazione della biotina in vivo¹³. Abbiamo sviluppato un metodo CLIP-seq modificato ^{chiamato Fbio}CLIP-seq(FLAG-Biotin-mediated Cross-linking e Immunoprecipitation seguito da sequenziamento ad alta produttività) utilizzando la purificazione tandem flag-biotina^{tag 14} (Figura 1). Attraverso la purificazione tandem e le rigorose condizioni di lavaggio, quasi tutti gli RRB interagenti vengono rimossi (Figura 2). Le rigorose condizioni di lavaggio consentono anche di aggirare l’SDS-PAGE e il trasferimento a membrana, che è ad alta intensità di manodopera e tecnicamente impegnativo. E simile a eCLIP e irCLIP, il ^{metodo Fbio}CLIP-seq è privo di isotopi. Saltare il gel in esecuzione e trasferire i passaggi evita la perdita di informazioni, mantiene intatte le autentiche interazioni proteina-RNA e aumenta la complessità della libreria. Inoltre, l’elevata efficienza del sistema di etichettatura lo rende una buona scelta per gli RMP senza anticorpi di alta qualità disponibili.

Qui forniamo una descrizione dettagliata del protocollo ^FBIoCLIP-seq per le cellule di mammifero. In breve, le cellule sono reticate da UV a 254 nm, seguite da lisi cellulare e immunoprecipitazione FLAG (FLAG-IP). Successivamente, i complessi proteina-RNA vengono ulteriormente purificati dalla cattura dell’affinità della biotina e gli RNA sono frammentati dalla digestione parziale con la MNasi. Quindi, l’RNA legato alla proteina viene defosforilato e legato con un linker 3 ‘. Un linker 5’ di RNA viene aggiunto dopo che l’RNA è fosforilato con PNK ed eluitato dalla digestione della proteinasi K. Dopo la trascrizione inversa, i segnali di RNA legati alle proteine vengono amplificati dalla PCR e purificati dalla purificazione del gel di agarosio. Due RMP sono stati scelti per esemplificare il ^{risultato di Fbio}CLIP-seq. LIN28 è una proteina legante l’RNA ben caratterizzata coinvolta nella maturazione dei microRNA, nella traduzione delle proteine e nella riprogrammazione^{cellulare 15,16,17}. WDR43 è una proteina wd40 contenente il dominio che si pensa coordini la biogenesi ribosoma, la trascrizione eucariotica e il controllo della pluripotenza delle cellule staminali embrionali^14,18. Coerentemente con i risultati precedentemente riportati per LIN28 con CLIP-seq, ^FbioCLIP-seq rivela siti di legame di LIN28 su motivi “GGAG” nel microRNA mir-let7g e^{mRNAAs 16,19} ( Figura3). WDR43 ^FbioCLIP-seq ha anche identificato la preferenza di associazione di WDR43 con distanziale trascritto esterno da 5′ (5′-ETS) di pre-rRNA²⁰ (Figura 4). Questi risultati convalidano l’affidabilità ^{del metodo FBIo}CLIP-seq.