Flag-Biotin Tandem Arınma Aracılı Çapraz Bağlama ve İmmünopits Ile Protein-RNA Etkileşimlerinin Transkripsiyon-Geniş Profilleme
Summary
Burada, memeli hücrelerinde RNA bağlayıcı proteinlerin (RRB) RNA hedeflerini belirlemek için FLAG-biotin tandem saflaştırma ile FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq protokolü salıyoruz.
Abstract
RNA ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB’ ler) birden fazla biyolojik işlemi kontrol eder. RNA’ların ve RRB’lerin mekansal ve zamansal düzenlemesi bu süreçlerin hassas bir şekilde düzenlenmesinin temelini oluşturur. ENdojen protein-RNA etkileşimlerini UV çapraz bağlanması ve ardından immünoprepitasyon ile yakalamak için CLIP-seq (çapraz bağlama ve immünopredimasyon) adı verilen bir strateji geliştirilmiştir. RBP çalışmasında konvansiyonel CLIP-seq yönteminin yaygın kullanımına rağmen, CLIP yöntemi yüksek kaliteli antikorların bulunabilirliği, saflaştırılmış RP’lerden potansiyel kirleticimaddeler, izotop manipülasyongereksinimi ve sıkıcı bir deneysel işlem sırasında potansiyel bilgi kaybı ile sınırlıdır. Burada FLAG-biotin etiketi tandem arınma kullanarak FbioCLIP-seq adlı değiştirilmiş bir CLIP-seq yöntemi ni tanımlıyoruz. Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, hemen hemen tüm etkileşen RNA bağlayıcı proteinler kaldırılır. Böylece, dolaylı olarak bu copurified RbPs aracılık rna’lar da azalır. FbioCLIP-seq metodumuz, sds-PAGE ve membran transfer prosedürleri olmadan doğrudan proteine bağlı RNA’ların izotopsuz ve proteine özgü antikorsuz bir şekilde etkin bir şekilde algılanmasını sağlar.
Introduction
RNA ve RNA bağlayıcı proteinler (RRB’ ler) birleştirme, çeviri, ribozom biyogenez, epigenetik regülasyon ve hücre kaderi geçişi1,2,3,4,5,6gibi çeşitli hücresel süreçleri kontrol eder. Bu süreçlerin hassas mekanizmaları RNA’ların ve RRB’lerin eşsiz mekansal ve zamansal düzenlemesine bağlıdır. Bu nedenle, rna regülasyonunu moleküler düzeyde anlama yolunda önemli bir adım, RP’lerin bağlayıcı bölgeleri hakkındaki konumsal bilgileri ortaya çıkarmaktır.
Bir strateji çapraz bağlama ve immünoprepitasyon olarak anılacaktır (CLIP-seq)uvçapraz bağlantı ile protein-RNA etkileşimleri yakalamak için geliştirilmiştir ilgi protein immünopreside ani 7. Metodolojinin en önemli özelliği, Bir RNA bağlayıcı protein ve doğrudan bağlı RNA molekülleri arasında kovalent çapraz bağlantıların indüksiyonudur (~ 1 şiçinde) UV ışınlama8. RBP ayak izleri, genellikle 30−60 nt çözünürlüğe sahip CLIP etiket kümeleme ve tepe arama ile belirlenebilir. Alternatif olarak, CLIP’in ters transkripsiyon adımı, tek nükleotid çözünürlükte RNA’larda protein bağlama sitelerinin tanımlanmasına olanak tanıyan çapraz bağlama sitelerine indels (eklemeler veya silmeler) veya ikamelere yol açabilir. Novoalign ve CIMS gibi boru hatları CLIP-seq8yüksek iş bölümü sekanslama sonuçlarının analizi için geliştirilmiştir. Çeşitli modifiye CLIP-seq yöntemleri de önerilmiştir, bireysel nükleotit çözünürlük çapraz bağlama ve immünoprepitasyon dahil (iCLIP), gelişmiş CLIP (eCLIP), irCLIP, ve fotoaktipabl ribonükleoside gelişmiş çapraz bağlama ve immünopredi (PAR-CLIP)9,10,11,12.
RRB’lerin çalışmasında geleneksel CLIP-seq yöntemlerinin yaygın kullanımına rağmen, CLIP yöntemlerinin çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, sıkıcı denatüre jel elektroforez ve membran transferi prosedürü bilgi kaybına yol açabilir, ve sınırlı dizi karmaşıklığına neden. İkinci olarak, proteine özgü antikor bazlı CLIP yöntemi tek bir hedef protein yerine bir protein kompleksini aşağı çekebilir, bu da saflaştırılmış RP’lerden yanlış pozitif protein-RNA etkileşimlerine yol açabilir. Dördüncü olarak, geleneksel CLIP yöntemi proteine bağlı RNA’ları etiketlemek için radiolabeled ATP gerektirir.
Streptavidin biyotinylated proteinlere yüksek yakınlık belirli proteinler veya protein kompleksleri arındırmak için çok güçlü bir yaklaşım yapar. Memeli hücrelerinde ektonik olarak ifade edilen bakteriyel BirA biotin ligaz ile yapay peptit dizilimini taşıyan proteinlerin verimli biyotinylation vivo biotin arıtma gerçekleştirmek için etkili bir strateji yapar13. Biz modifiye CLIP-seq yöntemi FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin aracılı Cross-lmürekkep ve benmmuno p recipitation yüksek iş itme takip) FLAG-biotin etiket tandem arıtma14 kullanarak geliştirdi (Şekil 1). Tandem arınma ve sıkı yıkama koşulları sayesinde, hemen hemen tüm etkileşen RRB’ler çıkarılır (Şekil 2). Sıkı yıkama koşulları, emek yoğun ve teknik açıdan zorlu olan SDS-PAGE ve membran transferinin de atlatılmasına olanak sağlar. Ve eCLIP ve irCLIP benzer, FbioCLIP-seq yöntemi izotop-free. Jel çalışan ve transfer adımları atlayarak bilgi kaybını önler, otantik protein-RNA etkileşimleri bozulmadan tutar ve kütüphane karmaşıklığını artırır. Ayrıca, etiketleme sisteminin yüksek verimlilik yüksek kaliteli antikorlar mevcut olmadan RbPs için iyi bir seçim yapar.
Burada memeli hücreleri için FbioCLIP-seq protokolü adım adım açıklamasını salıyoruz. Kısaca, hücreler çapraz bağlı 254 nm UV, hücre lysis ve FLAG immünopresipitasyon takip (FLAG-IP). Daha sonra, protein-RNA kompleksleri biotin afinite yakalama ile daha da saflaştırılır ve RNA’lar MNase ile kısmi sindirim ile parçalanır. Daha sonra proteine bağlı RNA fosforilasyona ve 3′ linker ile bağlanır. RNA PNK ile fosforlandırıldıktan ve proteinaz K sindirimi ile eluted sonra 5′ RNA bağlayıcı eklenir. Ters transkripsiyondan sonra, proteine bağlı RNA sinyalleri PCR ile yükseltilir ve agarose jel saflaştırma ile saflaştırılır. Fbio CLIP-seq sonucunu örneklemek için iki RRB seçildi. LIN28 mikroRNA olgunlaşma, protein çevirisi ve hücre yeniden programlama15,16,17dahil iyi karakterize RNA bağlayıcı proteindir. WDR43 ribozom biyogenez, ökaryotik transkripsiyon ve embriyonik kök hücre pluripotency kontrol koordine etmek için düşünülen bir WD40 etki alanı içeren protein14,18. CLIP-seq ile LIN28 için daha önce bildirilen sonuçlarla tutarlı olarak, FbioCLIP-seq mikroRNA mir-let7g ve mRNA’larda “GGAG” motifleri üzerinde LIN28’in bağlayıcı alanlarını ortaya çıkarır16,19 (Şekil 3). WDR43 FbioCLIP-seq ayrıca WDR43’ün bağlayıcı tercihini 5′ harici transkripsiyonlu spacers (5′-ETS) öncesi rRNA’lar20 (Şekil 4)ile belirlemİştir. Bu sonuçlar FbioCLIP-seq yönteminin güvenilirliğini doğrular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, protein-RNA komplekslerinin tandem arınmasını gerçekleştirmek için FLAG-biotin çift etiketleme sisteminden yararlanarak FbioCLIP-seq adı verilen değiştirilmiş bir CLIP-seq yöntemini tanıtıyoruz. FLAG-biotin çift etiketleme sistemi protein-protein ve protein-DNA etkileşimleri13,21belirlenmesinde güçlü olduğu gösterilmiştir. Burada, bu sistemin proteinlerle etkileşime girerken RNA’ları tanımlamada yüksek özgüllüğün?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hibe desteği Çin Ulusal Temel Araştırma Programı (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31630095) ve Tsinghua Üniversitesi Yaşam Bilimleri Merkezi’nden destek almaktadır.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
Referenzen
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3′ Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
