Perfilado en todo el transcriptoma de las interacciones entre proteínas y ARN por enlace cruzado e inmunoprecipitación mediada por la purificación en tándem FLAG-Biotin

Los ARN y las proteínas de unión al ARN (RRP) controlan diversos procesos celulares, incluyendo empalme, traducción, biogénesis ribosoma, regulación epigenética y transición del destino celular^1,2,3,4,5,6. Los delicados mecanismos de estos procesos dependen de la disposición espacial y temporal única de los ARN y los RRP. Por lo tanto, un paso importante hacia la comprensión de la regulación del ARN a nivel molecular es revelar la información posicional sobre los sitios de unión de los PBP.

Se ha desarrollado una estrategia denominada reticulación e inmunoprecipitación (CLIP-seq) para capturar las interacciones proteína-ARN con la reticulación UV seguida de la inmunoprecipitación de la proteína de interés⁷. La característica clave de la metodología es la inducción de enlaces cruzados covalentes entre una proteína de unión al ARN y sus moléculas de ARN directamente unidas (dentro de 1o) por irradiación UV⁸. Las huellas de RBP se pueden determinar mediante la agrupación en clústeres de etiquetas CLIP y las llamadas de pico, que suelen tener una resolución de 30 a 60 nt. Alternativamente, el paso de transcripción inversa de CLIP puede conducir a indels (inserciones o eliminaciones) o sustituciones a los sitios de enlace cruzado, lo que permite la identificación de sitios de unión a proteínas en los ARN con una resolución de un solo nucleótido. Se han desarrollado tuberías como Novoalign y CIMS para el análisis de los resultados de secuenciación de alto rendimiento de CLIP-seq^8. También se han propuesto varios métodos CLIP-seq modificados, entre ellos la transenlace y la inmunoprecipitación (iCLIP) con resolución de nucleótidos individuales, CLIP mejorado (eCLIP), irCLIP y fotoactivatable con reticulación y inmunoprecipitación (PAR-CLIP)^9,10,11,12.

A pesar del amplio uso de los métodos tradicionales CLIP-seq en el estudio de los PBP, los métodos CLIP tienen varios inconvenientes. En primer lugar, la tediosa electroforesis de gel desnaturalizante y el procedimiento de transferencia de membrana pueden conducir a la pérdida de información y causar una complejidad de secuencia limitada. En segundo lugar, el método CLIP basado en anticuerpos específicos de proteínas puede derribar un complejo proteico en lugar de una sola proteína diana, lo que puede dar lugar a interacciones de ARN proteico-proteína falsos de los RBP copurificados. En tercer lugar, la estrategia basada en anticuerpos requiere una gran cantidad de anticuerpos de alta calidad, lo que hace que la aplicación de estos métodos sea inadecuada para el estudio de los RMP sin anticuerpos de alta calidad disponibles. En cuarto lugar, el método CLIP tradicional requiere ATP radiomarcado para etiquetar los ARN unidos a proteínas.

La alta afinidad de la estreptavidina con las proteínas biotiniladas hace que sea un enfoque muy potente para purificar proteínas específicas o complejos proteicos. La biotinilación eficiente de proteínas que llevan una secuencia de péptidos artificiales por ligasa de biotina birA bacteriana expresada ectópicamente en células de mamíferos hace que sea una estrategia eficiente para realizar la purificación de biotina in vivo¹³. Desarrollamos un método CLIP-seq modificado llamado ^FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-mediated Cross-linking and Immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing) using FLAG-biotin tag tandem purification¹⁴ (Figura 1). Mediante la purificación en tándem y las estrictas condiciones de lavado, se eliminan casi todos los PBP que interactúan(Figura 2). Las estrictas condiciones de lavado también permiten eludir la transferencia de membranas y SDS-PAGE, que es intensiva en mano de obra y técnicamente difícil. Y al igual que eCLIP e irCLIP, el método ^FBIoCLIP-seq está libre de isótopos. Saltarse los pasos de funcionamiento y transferencia del gel evita la pérdida de información, mantiene intactas las interacciones proteína-ARN de proteínas y aumenta la complejidad de la biblioteca. Además, la alta eficiencia del sistema de etiquetado hace que sea una buena opción para los PBP sin anticuerpos de alta calidad disponibles.

Aquí proporcionamos una descripción paso a paso del protocolo ^FBIoCLIP-seq para células de mamíferos. En resumen, las células están reticuladas por UV de 254 nm, seguidas de la lelisis celular y la inmunoprecipitación FLAG (FLAG-IP). A continuación, los complejos de ARN proteico se purifican aún más mediante la captura de afinidad de biotina y los ARN se fragmentan por digestión parcial con MNase. Luego, el ARN unido a proteínas se desfosforila y ligado con un vinculador de 3′. Se añade un enlace de ARN de 5′ después de que el ARN se fosforila con PNK y se eluda por la digestión de la proteinasa K. Después de la transcripción inversa, las señales de ARN unidas a proteínas son amplificadas por PCR y purificadas por purificación de gel de agarosa. Dos PBP fueron elegidos para ejemplificar el resultado ^{de FBIo}CLIP-seq. LIN28 es una proteína de unión al ARN bien caracterizada implicada en la maduración del microARN, la traducción de proteínas y la reprogramación celular^15,16,17. WDR43 es una proteína que contiene dominios WD40 que se cree que coordina la biogénesis ribosoma, la transcripción eucariota y el control de pluripotencia de células madre embrionarias^14,18. De acuerdo con los resultados reportados previamente para LIN28 con CLIP-seq, ^FbioCLIP-seq revela sitios de unión de LIN28 en motivos “GGAG” en el microRNA mir-let7g y mRNAs^16,19 (Figura 3). WDR43 ^FBIoCLIP-seq también identificó la preferencia vinculante de WDR43 con espaciadores transcritos externos de 5′ (5′-ETS) de pre-rRNAs²⁰ (Figura 4). Estos resultados validan la fiabilidad del método ^FBIoCLIP-seq.