Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification

RNAs en RNA-bindende eiwitten (RBPs) controleren diverse cellulaire processen, waaronder splicing, vertaling, ribosoom biogenese, epigenetische regulatie en cellotovergang^1,2,3,4,5,6. De delicate mechanismen van deze processen zijn afhankelijk van de unieke ruimtelijke en temporele opstelling van RNAs en RBPs. Daarom is een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van RNA-regulatie op moleculair niveau het onthullen van de positionele informatie over de bindende sites van RBPs.

Een strategie aangeduid als cross-linking en immunoprecipitatie (CLIP-seq) is ontwikkeld om eiwit-RNA interacties met UV-kruisverband, gevolgd door immunoprecipitatie van het eiwit van belang⁷vast te leggen. Het belangrijkste kenmerk van de methodologie is de inductie van covalente kruisverbanden tussen een RNA-bindend eiwit en de direct gebonden RNA-moleculen (binnen ~1 Å) door UV-bestraling⁸. De RBP-voetafdrukken kunnen worden bepaald door cliptagclustering en piekbeling, die meestal een resolutie van 30−60 nt hebben. Als alternatief kan de omgekeerde transcriptiestap van CLIP leiden tot indels (invoegingen of verwijderingen) of vervangingen naar de kruisverkoppelingssites, waardoor eiwitbindende sites op de RNAs kunnen worden geïdentificeerd met een resolutie met één nucleotide. Pijpleidingen zoals Novoalign en CIMS zijn ontwikkeld voor de analyse van de high-throughput sequencing resultaten van CLIP-seq⁸. Er zijn ook verschillende gewijzigde CLIP-seq-methoden voorgesteld, waaronder cross-linking en immunoprecipitatie (iCLIP), verbeterde CLIP (eCLIP), irCLIP en foto-activiteiten van ribonucleoside-enhanced cross-linking en immunoprecipitatie (PAR-CLIP)^9,10,11,12.

Ondanks het brede gebruik van traditionele CLIP-seq methoden in de studie van RBPs, de CLIP methoden hebben verschillende nadelen. Ten eerste kan de vervelende gedenatureerde gel elektroforese en membraan overdracht procedure leiden tot verlies van informatie, en leiden tot beperkte volgorde complexiteit. Ten tweede kan de op eiwitten gebaseerde CLIP-methode een eiwitcomplex in plaats van één enkel doeleiwit naar beneden trekken, wat kan leiden tot vals-positieve eiwit-RNA-interacties van de copurified RBPs. Ten derde vereist de op antilichamen gebaseerde strategie een grote hoeveelheid hoogwaardige antilichamen, waardoor de toepassing van deze methoden ontoereikend is voor de studie van RBPs zonder beschikbare antilichamen van hoge kwaliteit. Ten vierde vereist de traditionele CLIP-methode radiogelabelde ATP om de eiwitgebonden RNAs te labelen.

De hoge affiniteit van streptavidin aan biotinylated eiwitten maakt het een zeer krachtige benadering om specifieke eiwitten of eiwitcomplexen te zuiveren. De efficiënte biotinylatie van eiwitten die een kunstmatige peptide sequentie door ectopisch uitgedrukt bacteriële BirA biotine ligase in zoogdiercellen maakt het een efficiënte strategie om biotine zuivering uit te voeren in vivo¹³. We ontwikkelden een gewijzigde CLIP-seq methode genaamd ^FbioCLIP-seq(FLAG-Biotin-gemedieerde Cross-linkt en ikmmunoprecipitatie gevolgd door high-throughput sequencing) met behulp van FLAG-biotine tag tandem zuivering¹⁴ (Figuur 1). Door middel van tandemzuivering en strenge wasomstandigheden worden bijna alle interagerende RBP’s verwijderd(figuur 2). De strenge wasomstandigheden maken het ook mogelijk om de SDS-PAGE en membraanoverdracht te omzeilen, wat arbeidsintensief en technisch uitdagend is. En vergelijkbaar met eCLIP en irCLIP, is de ^FbioCLIP-seq methode isotoopvrij. Het overslaan van de gel lopen en overdracht stappen vermijdt het verlies van informatie, houdt authentieke eiwit-RNA interacties intact, en verhoogt de complexiteit van de bibliotheek. Bovendien maakt de hoge efficiëntie van het tagging-systeem het een goede keuze voor RBPs zonder hoogwaardige antilichamen beschikbaar.

Hier geven we een stapsgewijze beschrijving van het ^FbioCLIP-seq protocol voor zoogdiercellen. Kortom, cellen zijn cross-linked door 254 nm UV, gevolgd door cellyse en FLAG immunoprecipitatie (FLAG-IP). Vervolgens worden de eiwit-RNA complexen verder gezuiverd door biotine affiniteit vastleggen en RNAs zijn gefragmenteerd door gedeeltelijke spijsvertering met MNase. Vervolgens wordt het eiwitgebonden RNA gedephosphorylated en met een 3′ linker gebonden. Een 5′ RNA linker wordt toegevoegd nadat het RNA is fosforylated met PNK en geëuterd door proteinase K spijsvertering. Na omgekeerde transcriptie worden de eiwitgebonden RNA-signalen versterkt door PCR en gezuiverd door agarose gelzuivering. Twee RBPs werden gekozen om de ^FbioCLIP-seq resultaat te illustreren. LIN28 is een goed gekarakteriseerd RNA-bindend eiwit dat betrokken is bij microRNA-rijping, eiwitvertaling en celherprogrammering^15,16,17. WDR43 is een WD40 domein-bevattende eiwit dacht te coördineren ribosoom biogenese, eukaryotische transcriptie, en embryonale stamcel pluripotentie controle^14,18. In overeenstemming met eerder gerapporteerde resultaten voor LIN28 met CLIP-seq, ^FbioCLIP-seq onthult bindende sites van LIN28 op “GGAG” motieven in de microRNA mir-let7g en mRNAs^16,19 (Figuur 3). WDR43 ^FbioCLIP-seq identificeerde ook de bindende voorkeur van WDR43 met 5′ externe transcribed spacers (5′-ETS) van pre-rRNAs²⁰ (Figuur 4). Deze resultaten valideren de betrouwbaarheid van de ^FbioCLIP-seq methode.