Çift DNA cetvelleri tek Nükledotid çözünürlüğe sahip Ribosome translocation mekanizmasını Incelemek için
Summary
Çift DNA cetvel tahlil ribozom translocation sırasında mRNA konumunu belirlemek için geliştirilmiştir, hangi oluşmuş DNA-mRNA dubliklerin ayrışma güçleri dayanır. Tek nükle çözünürlüğü ve mRNA ‘nın her iki ucunda ulaşmanın yeteneği ile, ribozom translokasyon ve prob diğer nüklik asit yerleşimleri için mekanik öngörüler sağlayabilir.
Abstract
Ribozom translokasyon tam olarak üç nükleotid (NT) tarafından mRNA üzerinde ribozomal hareket anlamına gelir, hangi protein sentezi merkezi adımdır. Mekanizmasını araştırmak için iki temel teknik şart vardır. İlki, ribozom ‘ın 3 NT ‘den başka tarafından hareket ettiği frameshifting ‘den normal translokasyon çözümünü çözebilecek tek NT çözünürlüğüyle olur. İkincisi, translocation tüm resmi aydınlatmak için mRNA giriş ve çıkış kenarlarını prob yeteneğine sahiptir. Biz DNA-mRNA duplexes kritik ayrışma güçleri dayanmaktadır çift DNA cetvel tahlil rapor, kuvvet kaynaklı kalıntı magnetizasyon spektroskopisi (firmalar) ile elde. 2-4 PN kuvvet çözünürlüğü ile çift cetvel tahlil farklı translokasyon adımlarını ayırt etmek için yeterlidir. Uzun bir bağlayıcı yoklama DNAs üzerinde uygulayarak, mRNA pozisyonu her iki taraf için belirlenecek şekilde ribosome karşı tarafında mRNA ulaşabilir. Bu nedenle, Çift cetvel tahlil benzersiz ribozom translocation araştırmak için uygundur, ve genel olarak nüklik asit hareketi. Biz bir ilmekledi mRNA konformasyonu ve frameshifting normal translokasyon çözüldü belirtilen temsili sonuçlar gösterir.
Introduction
Biomoleküler deplasman, ilgili biyolojik fonksiyonların mekanizmasını inceleyerek temel bir parametredir. Belirli bir örnek, ribozom ‘in haberci RNA(mRNA) üzerinde tam olarak üç nükleotides (NT) ile hareket ettiği, normal olarak ve bir, iki ya da diğer NT numaralarıyla üç hariç, bir,2, ribozom geçiş konumdur. frameshifting. Bu nedenle, farklı adım boyutlarını ayırt etmek için bir moleküler cetvel sistemi tek NT çözünürlüğü gereklidir. Daha büyük bir zorluk hem giriş hem de çıkış taraflarında ribozom hareketini araştırmanız. Başka bir deyişle, sadece bir çift cetvel sistemi ile biz mRNA düzgün ribosome üzerinden dişli olup olmadığını ortaya çıkarmak mümkün olacak, ya da iki tarafın farklı adım boyutları içinde bir bükülen veya ilmekledi mRNA konformasyon yol olan ara adımlar vardır ribozom.
Ribozom (mRNA 3 ‘ sonu) çıkış tarafında farklı adımlar çözme ilk zorluk gidermek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Çift Lusiferaz tahlil farklı okuma çerçeveleri ortaya çıkan farklı proteinlerin oranlarını ölçmek tarafından giderir3,4. Sadece mRNA 3 ‘ End için geçerlidir ve böylece translocation tam bir resim sağlamak için yetersiz. Kütle spektrometresi, ilgili kod yeniden düzenlemelerinin sonucu olarak farklı peptit parçalarını analiz edebilir5. Ama mRNA üzerinde ribozom hamle kaç NT için tespit edemez. Toe-baskı tahlil ribozom doğru mRNA dönüştürme 3 ‘-distal ucunda astar ters transkriptaz kullanan başka bir ortak yöntemdir6. Ancak, ribosome giren mRNA 5 ‘ End için geçerli değildir. Tek molekül yaklaşımlar ve floresan yöntemleri7de dahil olmak üzere diğer teknikler, tek NT çözünürlüğü elde etmek zordur.
Biz benzersiz ribosome-mRNA kompleksler içinde açılan mRNA giriş ve çıkış konumlarını hem de belirleyebilirsiniz çift DNA cetvel assay geliştirdik. Cetvel DNAS, mRNA ‘nın hangi ucunda olursa olsun, ribosome tarafından ortaya çıkarılan mRNA ile belirli sayıda basepairs (BP) ‘ nin dubleksler formunu içeren DNA oligomerdir. BP numaraları daha sonra translocation sırasında mRNA üzerindeki ribozom konumunu kesin olarak ortaya çıkarır. Dubliklerin BP numaraları, kuvvet kaynaklı kalıntı magnetizasyon spektroskopisi (firmalar)8‘ den elde edilen kritik ayrışma güçleri tarafından belirlenir. 2-3 pN kuvvet belirsizlik ile, kritik güçler tek NT çözünürlük sunmak için yeterlidir. DNA cetvelleri üzerinde bir bağlayıcı molekül uygulayarak, ribozom tarafından mRNA sterollerdir engellenmiş yan probed olabilir. Farklı ribozomal kesimleri böylece doğru çözülebilir. Biz başarıyla translokasyon9sırasında antibiyotikler tarafından sıkışmış mRNA benzersiz bir ilmekledi uyum ortaya koymuştur ve bir kaygan mRNA sırası10üzerinde birlikte farklı okuma çerçeveleri çözüldü. Bu makalede, ribozom kompleksleri hazırlanması, cam slaytlar yüzey functionalization, ribozom kompleksleri immobilizasyonu ve manyetik etiketli DNA cetvel ile hibridizasyon dahil çift cetvel tahlil, ayrıntılarını açıklar moleküller, Manyetik algılama ve kuvvet spektrum analizi FIRMALARı tarafından.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim çift cetvel tahlil, manyetik boncuklar iki temel roller oynar. İlk olarak, onlar güç dönüştürücülerinin olarak hizmet vermektedir, çünkü merkezkaç kuvveti onların batmaz kütle ile orantılı. İkincisi, boncuklar, şu anda en doğru manyetik sensör olan atomik Manyetometre ile algılanan sinyal taşıyıcılarıdır. Mekanik manipülasyon ve manyetik algılamayı birleştiren fırmalar tekniği, DNA cetvellerinin temeli olan kritik dağılma kuvvetlerine göre çok sayıda moleküler etkileşimi ç…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM111452, Y.W., S.X.) tarafından desteklenmektedir. Y. W. Welch Vakfı (E-1721) desteğini onaylar.
Materials
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
Referenzen
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an “mRNA looping” intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency “-1” and “-2” ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
