Los gobernantes de ADN dual estudiarán el mecanismo de la translocación ribosoma con resolución de un solo nucleótido

El desplazamiento biomolecular es un parámetro fundamental en el estudio del mecanismo de las funciones biológicas relacionadas. Un ejemplo particular es la translocación ribosoma^1,2, durante la cual el ribosoma se mueve exactamente por tres nucleótidos (nt) en el ARN mensajero (arNM) normalmente, y por uno, dos u otros números de nt excepto tres en el caso de cambio de marco. Por lo tanto, se requiere una resolución de un solo nt del sistema de reglas moleculares para distinguir los diferentes tamaños de paso. Un desafío mayor es sondear el movimiento ribosoma tanto en el lado de entrada como en el de salida. En otras palabras, sólo con un sistema de doble regla podremos revelar si el ARNm se enhebra suavemente a través del ribosoma, o hay pasos intermedios en los que los dos lados tienen diferentes tamaños de paso que conducen a una conformación de ARNm torcido o en bucle dentro de la Ribosoma.

Se han desarrollado varios métodos para abordar el primer reto de resolver diferentes pasos en el lado de salida del ribosoma (el extremo de 3′ del ARNm). El ensayo de doble luciferasa resuelve los diferentes marcos de lectura midiendo las proporciones de las diferentes proteínas resultantes^3,4. Sólo es aplicable para el extremo de 3′ del ARNm y, por lo tanto, insuficiente para proporcionar una imagen completa de la translocación. La espectrometría de masas puede analizar los diferentes fragmentos de péptidos como consecuencia de los correspondientes reordenamientos de código⁵. Pero no puede identificar cuántos movimientos ribosomas en el ARNm. El ensayo de impresión de dedos de los dedos es otro método común que utiliza una transcriptasa inversa cebada en el extremo distal de 3’para transcribir el ARNm hacia el ribosoma⁶. Sin embargo, no es aplicable para el extremo de 5′ de ARNm que está entrando en el ribosoma. Otras técnicas, incluyendo enfoques de molécula única y métodos de fluorescencia⁷, son difíciles de lograr una resolución de un solo nt.

Hemos desarrollado el ensayo de la regla de ADN dual que puede determinar de manera única las posiciones de entrada y salida del ARNm descubierto en los complejos ribosoma-mRNA.  Los DN a la regla son oligómeros de ADN que forman dúplex de ciertos números de pares de bases (bp) con el ARNm descubierto por el ribosoma, independientemente de qué extremo del ARNm. Los números bp revelan con precisión la posición ribosoma en el ARNm durante la translocación. Los números bp de los dúplex están determinados por sus fuerzas de disociación crítica obtenidas a partir de la espectroscopia de magnetización remanente inducida por la fuerza (FIRMS)⁸. Con una incertidumbre de fuerza de 2-3 pN, las fuerzas críticas son suficientes para ofrecer una resolución de un solo nt. Mediante la implementación de una molécula de vinculador en las reglas de ADN, el lado esterrámico obstaculizado del ARNm por el ribosoma puede ser sondeado. Por lo tanto, se pueden resolver con precisión los diferentes desplazamientos ribosomales. Hemos revelado con éxito una conformación única en bucle de ARNm atrapado por antibióticos durante la translocación^9,y resuelto diferentes marcos de lectura que coexistían en una secuencia de ARNm resbaladizo^10. Este artículo describe los detalles del ensayo de doble regla, que incluyen la preparación de los complejos ribosomas, la funcionalización superficial de los portaobjetos de vidrio, la inmovilización de los complejos ribosomas y su hibridación con la regla de ADN etiquetada magnéticamente moléculas, detección magnética y análisis del espectro de fuerza por PARTE de FIRMS.