Dubbele DNA-linialen om het mechanisme van ribosome translocatie te bestuderen met single-nucleotide-resolutie
Summary
Dubbele DNA-liniaal assay is ontwikkeld om de mRNA-positie tijdens ribosoom translocatie te bepalen, die afhankelijk is van de dissociatie krachten van de gevormde DNA-mRNA-duplexen. Met single-nucleotide resolutie en mogelijkheid van het bereiken van beide uiteinden van mRNA, het kan mechanistische inzichten bieden voor ribosoom translocatie en sonde andere nucleïnezuur verplaatsingen.
Abstract
De ribosoom translocatie verwijst naar de ribosomale beweging op de mRNA door exact drie nucleotiden (NT), wat de centrale stap is in de eiwitsynthese. Om het mechanisme te onderzoeken zijn er twee essentiële technische vereisten. Ten eerste is een single-NT-resolutie die normale translocatie van frameshifting kan oplossen, waarbij het ribosoom met andere dan 3 NT beweegt. De tweede is de mogelijkheid om te sonde zowel de ingang en de uitgang van de zijden van mRNA om het hele beeld van translocatie te verhelderdateren. We rapporteren de dubbele DNA-liniaal test die is gebaseerd op de kritische dissociatie krachten van DNA-mRNA-duplexen, verkregen door kracht-geïnduceerde overblijfsel magnetisatie spectroscopie (firma’s). Met 2-4 pN Force Resolution is de dubbele liniaal test voldoende om verschillende translocatie stappen te onderscheiden. Door een lange linker op de indringende dna’s te implementeren, kunnen ze de mRNA aan de andere kant van het ribosome bereiken, zodat de mRNA-positie voor beide zijden kan worden bepaald. Daarom is de dubbele liniaal test uniek geschikt om de ribosoom translocatie en nucleïnezuur beweging in het algemeen te onderzoeken. We tonen representatieve resultaten die een lus mRNA-conformatie en een opgeloste normale translocatie van frameshifting hebben aangegeven.
Introduction
Biomoleculaire verplaatsing is een fundamentele parameter bij het bestuderen van het mechanisme van de verwante biologische functies. Een specifiek voorbeeld is de ribosoom translocatie1,2, waarbij het ribosoom beweegt door exact drie nucleotiden (NT) op het boodschapper-RNA (mRNA) normaal, en door één, twee of andere nummers van NT behalve drie in het geval van frameshifting. Daarom is een moleculaire liniaal systeem single-NT-resolutie vereist om onderscheid te maken tussen de verschillende stapgroottes. Een grotere uitdaging is om de ribosoom beweging op zowel de ingangs-als de uitgangszijde te sonde. Met andere woorden, alleen met een dubbele liniaal systeem zullen we in staat zijn om te onthullen of de mRNA soepel door het ribosome is verbonden, of er zijn tussenliggende stappen waarbij de twee zijden verschillende stap maten hebben die leiden tot een knikte of lus mRNA-conformatie in de ribosoom.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de eerste uitdaging aan te pakken bij het oplossen van verschillende stappen aan de uitgang van het ribosoom (het 3 ‘ uiteinde van de mRNA). De dubbele plaats-assay lost de verschillende Lees frames op door de verhoudingen van de resulterende verschillende eiwitten3,4te meten. Het is alleen van toepassing voor het 3 ‘ einde van de mRNA en dus onvoldoende om een volledig beeld van translocatie te bieden. Massaspectrometrie kan de verschillende peptide fragmenten analyseren als gevolg van de overeenkomstige code herschikkingen5. Maar het kan niet aangeven hoeveel NT het ribosoom beweegt op de mRNA. De toe-Printing test is een andere veelgebruikte methode die een reverse transcriptase gebruikt die op het 3 ‘-distale uiteinde wordt geprimeerd om de mRNA in de richting van het ribosoom6te transcriberen. Het is echter niet van toepassing op het 5 ‘ einde van mRNA dat het ribosome binnenkomt. Andere technieken, waaronder enkelvoudige molecuul benaderingen en fluorescentie methoden7, zijn moeilijk te bereiken met een enkele NT-resolutie.
We hebben de dubbele DNA-liniaal test ontwikkeld die op unieke wijze zowel de ingangs-als uitgangsposities van de ongedekte mRNA in ribosome-mRNA-complexen kan bepalen. De liniaal-Dna’s zijn DNA-oligomeren die duplexen vormen van bepaalde aantallen baseparen (BP) met de mRNA die door het ribosome worden blootgelegd, ongeacht welk uiteinde van de mRNA. De BP-nummers onthullen dan precies de ribosoom positie op de mRNA tijdens translocatie. De BP-nummers van de Duplexen worden bepaald door hun kritische dissociatie krachten verkregen uit door kracht geïnduceerde overblijfsel magnetisatie spectroscopie (firma’s)8. Met 2-3 pN-kracht onzekerheid zijn de kritische krachten voldoende om single-NT-resolutie aan te bieden. Door het implementeren van een linker molecuul op de DNA-linialen, kan de sterisch-belemmerde zijde van de mRNA door het ribosoom worden geprobed. Verschillende ribosomale verplaatsingen kunnen dus nauwkeurig worden opgelost. We hebben met succes onthuld een unieke lus conformatie van mRNA gevangen door antibiotica tijdens translocatie9, en opgelost verschillende Lees kaders die naast elkaar bestonden op een gladde mRNA sequentie10. Dit artikel beschrijft de details van de dubbele liniaal Assay, waaronder de voorbereiding van de ribosoom complexen, oppervlakte functionalisatie van de glasplaten, immobilisatie van de ribosoom complexen en hun hybridisatie met magnetisch gelabelde DNA-liniaal moleculen, magnetische detectie en kracht spectrum analyse door bedrijven.
Protocol
Representative Results
Discussion
In onze dubbele liniaal testspelen de magnetische kralen twee essentiële rollen. Ten eerste dienen ze als de kracht transducers omdat de centrifugale kracht evenredig is aan hun drijvende massa. Ten tweede, de parels zijn signaal dragers gedetecteerd door een atomaire magnetometer, die momenteel de meest nauwkeurige magnetische sensor. Door mechanische manipulatie en magnetische detectie te combineren, kan de techniek van de FIRMA’S een groot aantal moleculaire interacties oplossen op basis van hun kritische dissociatie…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gesteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. erkent de steun van de Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
Referenzen
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an “mRNA looping” intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency “-1” and “-2” ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
