I governanti del DOPPIO DNA studiano il meccanismo della traslocazione del ribosoma con la risoluzione Single-Nucleotide

Lo spostamento biomolecolare è un parametro fondamentale nello studio del meccanismo delle funzioni biologiche correlate. Un esempio particolare è la traslocazione ribosoma^1,2, durante la quale il ribosoma si muove esattamente da tre nucleotidi (nt) sull’RNA messaggero (mRNA) normalmente, e da uno, due o altri numeri di nt tranne tre nel caso di frameshifting. Pertanto, è necessario un sistema di righello molecolare a risoluzione a virgola singola per distinguere le diverse dimensioni del passo. Una sfida più grande è quella di sondare il movimento del ribosoma su entrambi i lati di entrata e di uscita. In altre parole, solo con un sistema a doppio righello saremo in grado di rivelare se l’mRNA è filettato senza intoppi attraverso il ribosoma, o ci sono passaggi intermedi in cui i due lati hanno dimensioni di gradino diverse che portano a una conformazione di mRNA piegata o loop all’interno del Ribosoma.

Sono stati sviluppati diversi metodi per affrontare la prima sfida di risolvere diversi passi sul lato di uscita del ribosoma (la fine del 3′ dell’mRNA). Il doppio saggio luciferasi risolve i diversi fotogrammi di lettura misurando i rapporti delle diverse proteine risultanti^3,4. È applicabile solo per l’estremità 3′ dell’mRNA e quindi insufficiente a fornire un quadro completo della traslocazione. La spettrometria di massa può analizzare i diversi frammenti di peptidi come conseguenza dei corrispondenti riarrangiamenti del codice⁵. Ma non può individuare quanti nt il ribosoma si muove sull’mRNA. Il test di stampa della dito della luce è un altro metodo comune che utilizza una trascrizione inversa innescata all’estremità 3′-distale per trascrivere l’mRNA verso il ribosoma⁶. Tuttavia, non è applicabile per la fine 5′ dell’mRNA che sta entrando nel ribosoma. Altre tecniche, tra cui approcci a singola molecola e metodi di fluorescenza⁷, sono difficili da raggiungere una risoluzione a due.

Abbiamo sviluppato il doppio saggio del righello del DNA in grado di determinare in modo univoco sia le posizioni di ingresso che di uscita dell’mRNA scoperto nei complessi di ribosomi-mRNA.  I DNA righelli sono oligomeri di DNA che formano duplex di un certo numero di coppie di base (bp) con l’mRNA scoperto dal ribosoma, indipendentemente dalla fine dell’mRNA. I numeri bp poi rivelano con precisione la posizione del ribosoma sull’mRNA durante la traslocazione. I numeri bp dei duplex sono determinati dalle loro forze critiche di dissociazione ottenute dalla spettroscopia di magnetizzazione della magnetizzazione di residua indotta dalla forza (FIRMS)⁸. Con 2-3 pN di incertezza forza, le forze critiche sono sufficienti per offrire una risoluzione mono-nt. Implementando una molecola del linker sui righelli del DNA, il lato sterically ostacolato dell’mRNA dal ribosoma può essere sondato. Diversi spostamenti di ribosomia possono quindi essere risolti con precisione. Abbiamo rivelato con successo un’unica conformazione loopdiforme di mRNA intrappolata dagli antibiotici durante la traslocazione⁹, e risolto diversi fotogrammi di lettura che coesistevano su una sequenza di mRNA scivolosa¹⁰. Questo articolo descrive i dettagli del saggio a doppio righello, che includono la preparazione dei complessi ribosomi, la funzionalizzazione superficiale dei vetrini di vetro, l’immobilizzazione dei complessi di ribosomi e la loro ibridazione con righello di DNA etichettato magneticamente molecole, rilevamento magnetico e analisi dello spettro di forza da parte di FIRMS.