단일 뉴클레오티드 해상도로 리보솜 전좌의 메커니즘을 연구하는 이중 DNA 통치자
Summary
이중 DNA 눈자 분석은 형성된 DNA-mRNA 이중의 해리력에 의존하는 리보솜 전좌 동안 mRNA 위치를 결정하기 위하여 개발됩니다. 단일 뉴클레오티드 분해능과 mRNA의 양 단에 도달하는 기능을 통해 리보솜 전좌에 대한 기계적 통찰력을 제공하고 다른 핵산 변위를 조사할 수 있습니다.
Abstract
리보솜 전좌는 단백질 합성에 있는 중앙 단계인 정확하게 3개의 뉴클레오티드 (nt)에 의해 mRNA에 리보솜 운동을 나타납니다. 메커니즘을 조사하기 위해 두 가지 필수 기술 요구 사항이 있습니다. 첫 번째는 리보솜이 3 nt 를 제외한 다른 것으로 이동하는 동안 프레임 변속에서 정상적인 전좌를 해결할 수있는 단일 nt 해상도입니다. 두 번째는 전좌의 전체 그림을 해명하기 위해 mRNA의 입구와 출구 측면을 모두 조사 할 수있는 기능입니다. 우리는 힘 유도된 잔재 자화 분광학에 의해 장악된 DNA-mRNA 이중의 중요한 해리력에 근거를 둔 이중 DNA 통치자 분석법을 보고합니다 (FIRMS). 2-4 pN 힘 분해능을 사용하면 이중 눈자압 분석이 서로 다른 전좌 단계를 구별하기에 충분합니다. 프로빙 DRNA에 긴 링커를 구현함으로써, 그들은 리보솜의 반대편에 있는 mRNA에 도달할 수 있고, 그래서 mRNA 위치는 양측을 위해 결정될 수 있다. 따라서, 이중 눈금자 분석은 리보솜 전좌 및 일반적으로 핵산 운동을 조사하는 데 유일하게 적합하다. 우리는 루프 mRNA 형태와 프레임 변속에서 정상 전좌를 해결 한 대표적인 결과를 보여줍니다.
Introduction
생체 분자 변위는 관련 생물학적 기능의 메커니즘을 연구하는 근본적인 매개 변수입니다. 한 가지 특별한 예는 리보솜 전좌1,2,리보솜이 메신저 RNA(mRNA)에 대해 정확히 3개의 뉴클레오티드(nt)에 의해 정상적으로 이동하는 동안, 그리고 3개를 제외한 1, 2, 또는 다른 수의 nt가 프레임 변속. 따라서, 분자 눈금자 시스템 단일-nt 해상도는 상이한 단계 크기를 구별하는 데 필요하다. 더 큰 과제는 입구와 출구 양쪽 모두에서 리보솜 움직임을 조사하는 것입니다. 즉, 이중 눈금자 시스템으로만 mRNA가 리보솜을 통해 원활하게 스레드되는지, 또는 양측이 서로 다른 단계 크기를 가지는 중간 단계가 있는지 여부를 밝힐 수 있을 것입니다. 리보솜.
리보솜의 출구 측에 있는 다른 단계를 해결하는 첫번째 도전을 해결하기 위하여 몇몇 방법 (mRNA의 3′ 끝)를 해결하기 위하여 개발되었습니다. 이중 루시퍼라제 분석기는 생성된 상이한 단백질의 비율을 측정하여상이한 판독 프레임을 3,4로해결한다. 그것은 단지 mRNA의 3′ 끝에 적용 하 고 따라서 전좌의 전체 그림을 제공 하기 위해 부족. 질량 분석법은 대응하는 코드 재배열의 결과로 상이한 펩티드단편을 분석할 수 있다 5. 그러나 mRNA에 리보솜이 얼마나 많은 nt 이동하는지 정확히 파악할 수 없습니다. 발가락 프린팅 분석법은 리보솜 6을 향해 mRNA를 전사하기 위해 3′-말단에서 프라이밍된 역전사를사용하는 또 다른 일반적인 방법이다. 그러나 리보솜에 들어가는 mRNA의 5′ 말단에는 적용되지 않는다. 단일 분자 접근법 및 형광 방법 7을포함하는 다른 기술은 단일 nt 분해능을 달성하기 어렵다.
우리는 리보솜-mRNA 복합체에 있는 밝혀진 mRNA의 입구 그리고 출구 위치를 둘 다 유일하게 결정할 수 있는 이중 DNA 통치자 분석약을 개발했습니다. 통치자 DNA는 mRNA의 어느 말단에 관계없이 리보솜에 의해 발견된 mRNA와 염기쌍 (bp)의 특정 수의 이중을 형성하는 DNA 올리고머입니다. bp 숫자는 전좌 도중 mRNA에 리보솜 위치를 정확하게 드러냅니다. 이중의 bp 수는 힘 유도 된 잔류 자화 분광기 (FIRMS) 8에서 얻은 임계 해리력에의해 결정됩니다. 2-3 pN 힘 불확도를 가진, 임계 힘은 단일 nt 분해능을 제공하기에 충분합니다. DNA 눈자에 링커 분자를 구현함으로써, 리보솜에 의해 mRNA의 스테리컬 방해 측을 조사할 수 있다. 따라서 다른 리보좀 변위를 정확하게 해결할 수 있습니다. 우리는 전좌9동안 항생제에 의해 갇혀 있는 mRNA의 독특한 고리 형태형성을 성공적으로 밝혀냈으며, 미끄러운 mRNA 서열10에공존하는 상이한 판독 프레임을 해결했다. 이 기사에서는 리보솜 복합체의 준비, 유리 슬라이드의 표면 기능화, 리보솜 복합체의 고정화 및 자기 표지된 DNA 눈금자와의 혼성화를 포함하는 이중 통치자 분석법의 세부 사항을 설명합니다. 분자, 자기 검출 및 기업에 의한 힘 스펙트럼 분석.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 이중 통치자 분석에서, 자기 구슬은 두 가지 중요한 역할을한다. 첫째, 원심력이 부력 질량에 비례하기 때문에 힘 변환기 역할을합니다. 둘째, 비드는 현재 가장 정확한 자기 센서인 원자 자력계에 의해 감지되는 신호 캐리어입니다. 기계적 조작과 자기 검출을 결합한 FIRMS 기술은 DNA 통치자의 기초가 되는 중요한 해리력을 기반으로 많은 분자 상호 작용을 해결할 수 있습니다. 이중 눈자 분…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원됩니다 (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. 웰치 재단 (E-1721)의 지원을 인정합니다.
Materials
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
Referenzen
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
- Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
- Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
- Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
- Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
- Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
- De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an “mRNA looping” intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
- Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency “-1” and “-2” ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
- Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
- Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
- Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
- Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
- Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
- Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
- Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).
