Summary

في فيفو الحقن المجسمة داخل الدماغ لتحفيز البصريات من المدخلات بعيدة المدى في شرائح الدماغ الماوس

Published: September 20, 2019
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق لتحديد الاتصال الوظيفي الخاص من نوع الخلية من المدخلات طويلة المدى من مناطق الدماغ البعيدة باستخدام التحفيز البصري في شرائح الدماغ في الجسم الحي السابق.

Abstract

معرفة من نوع الخلية اتصال متشابك محددة هو شرط مسبق حاسم لفهم الدوائر العصبية على نطاق الدماغ. التحقيق الوظيفي للاتصالات طويلة المدى يتطلب تسجيلات مستهدفة من الخلايا العصبية واحدة جنبا إلى جنب مع التحفيز المحدد للمدخلات البعيدة المحددة. وغالبا ً ما يكون من الصعب تحقيق ذلك باستخدام تقنيات التحفيز التقليدية والكهربائية، لأن المحاور من مناطق الدماغ المتقاربة في المنبع قد تختلط في المنطقة المستهدفة. ويتيح استهداف منطقة دماغية محددة لتعبير قنوات أيون حساسة للضوء بتسمع مجسم ة من قبل الفيروس التحفيز الانتقائي للمحاور الناشئة من تلك المنطقة بالضوء. يمكن استخدام الحقن المجسمة داخل الدماغ في هياكل محددة جيدا، مثل النوى الثالية الأمامية، بالإضافة إلى المناطق الأخرى تحت القشرية أو القشرية في جميع أنحاء الدماغ.

وصف هنا هو مجموعة من التقنيات لحقن مجسمة دقيقة من ناقلات الفيروسية التي تعبر عن channelrhodopsin في الدماغ الماوس، تليها التحفيز الضوئي للمحطات axon في إعداد شريحة الدماغ. وهذه البروتوكولات بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع. في تركيبة مع كامل الخلية التصحيح تسجيل المشبك من الخلايا العصبية المتصلة postsynaptically، والتحفيز الضوئي للمحاور يسمح الكشف عن الاتصالات متشابك وظيفية، والتوصيف الدوائي، وتقييم قوتها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام ملء السيتين من الخلايا العصبية المسجلة لتحديد مورفولوجيما ما بعد مخصص للخلية العصبية postynaptic.

Introduction

تعريف الاتصال بين مناطق الدماغ ضروري لفهم الدوائر العصبية. تسمح أساليب التتبع التشريحي الكلاسيكية بإنشاء اتصال أقاليمي، وتساعد دراسات الآفات على فهم التنظيم الهرمي لتدفق المعلومات. على سبيل المثال، دوائر الدماغ للاتجاه المكاني واتجاه الرأس الإشارات تنطوي على تدفق الاتجاه من المعلومات من المهاد إلى presubiculum. وقد ثبت هذا من خلال دراسات الآفات من النوى الثالية الصدغية الصدغية (ADN) التي تتحلل إشارة اتجاه الرأس في presubiculum الظهرية المصب، فضلا عن إشارة خلية الشبكة parahippocampal1،2.

الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ هو أكثر صعوبة في إنشاء على مستوى الخلوية ودون الخلوية. في الحصين، يسمح التشريح المنظم للغاية بالتحقيق في اتصالات متشابكة خاصة بالمسار باستخدام المحاكاة الكهربائية في إعداد الشريحة. يمكن استخدام أقطاب التحفيز الموضوعة في طبقة الراديوتوم من CA1 لتحفيز المدخلات الجانبية شافر على وجه التحديد من CA33. تحفيز الأقطاب الكهربائية وضعت في الطبقة lacunosum الجزيئية من CA1 سوف تنشيط مدخلات مسار مثقب إلى CA14،5. التحفيز الكهربائي ينشط الإفراج العصبي من محطات axon; ومع ذلك، فإنه ينشط الخلايا العصبية مع سوماتا بالقرب من موقع التحفيز، فضلا عن محاور المرور. ولذلك فهي ذات استخدام محدود لدراسة الأوفيرينتس من مناطق الدماغ المحددة عندما تختلط الألياف من مناطق منشأ مختلفة في الهيكل المستهدف، كما هو الحال عادة في القشرة الجديدة.

ويمكن أيضا تحفيز الخلايا العصبية مع الضوء. وتشمل الطرق البصرية التنشيط الضوئي للغلوتامات القفص، والتي يمكن الجمع بينها وبين واحد أو اثنين من المسح الضوئي بالليزر الفوتون. يمكن تحفيز مواقع متعددة متباعدة بشكل وثيق بالتتابع، مع عدم وجود ضرر ميكانيكي للأنسجة6. وقد استخدم هذا بنجاح لرسم خريطة مستقبلات متشابك وكذلك تنشيط الخلايا العصبية الفردية7. في حين يمكن استخدام الغلوتامات في تحليل الدوائر المحلية، فإنه لا يسمح لتنشيط محددة من المدخلات طويلة المدى.

طريقة الاختيار للتحقيق في الاتصال بعيد المدى في الدوائر العصبية هو استخدام التعبير channelrhodopsin بوساطة الفيروس. باستخدام الحقن المجسمة في الجسم الحي كما هو موضح هنا، يمكن استهداف التعبير عن قنوات أيون ذات بوابات خفيفة ويقتصر مكانيا على منطقة الدماغ المطلوبة. وبهذه الطريقة، تكون القنوات فعالة لرسم خرائط الاتصال المحفز أو المثبط من منطقة إلى هدفها. يمكن تحفيز محطات المحاور المتحولة مع الضوء في إعداد شريحة الدماغ، وتسجيلات التصحيح المشبك كقراءة تسمح بفحص وظائف ونقاط القوة من مكونات دائرة محددة في الدماغ8. النهج البصري جنبا إلى جنب مع حقن مجسمة من الفيروس يقدم خصوصية غير مسبوقة والسيطرة الوراثية9. تحفيز مع الضوء بالإضافة إلى ذلك يسمح لكل من الدقة الزمنية والمكانية العالية10،11.

وpresubiculum هو هيكل القشرية من ست طبقات في الانتقال من الحصين وتشكيل شبه فرس النهر12،13. هو يستلم مساهمة مهمّة متشابكة من ال [أدن]11 غير أنّ أيضا من عدّة أخرى [كورتك] ومناطق تحتالقشريّة 14. وهكذا، فإن التحفيز الانتقائي لمحطات المحاور الثلاميك داخل شريحة ما قبل الخضوع غير ممكن مع التحفيز الكهربائي ولا الغلوتامات المنقطع. الموصوفة في هذا البروتوكول هي طرق لتحديد الاتصال الوظيفي بين مناطق الدماغ (ADN وpresubiculum) باستخدام حقن مجسمة دقيقة من النواقل الفيروسية التي تعبر عن قنوات ذات بوابات خفيفة. كما وصف هو التحفيز الضوئي للمحطات axons من إسقاط الخلايا العصبية في منطقتهم المستهدفة، إلى جانب تسجيلات التصحيح المشبك الخلية الكاملة من الخلايا العصبية ما بعد متشابك في إعداد شريحة الدماغ.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لتوجيه مجلس الجماعة الأوروبية (2010/63/EU) ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في جامعة باريس ديكارت. يجب على المُجرِّب الحصول على تفويض لإجراء الامتثال للوائح المحلية. 1- تخطيط التجربة حدد منطقة الدماغ التي سيتم استهدافها. تحديد إحداثيات stereotaxic من مو?…

Representative Results

وقد استخدم الإجراء المعروض هنا للتعبير عن قناة زرقاء حساسة للضوء (كرونوس) تنصهر إلى GFP في النواة الأبهرية الظهرية للالمهاد (ADN)، عن طريق حقن مجسم ة من الفيروس المرتبط بالغدة الدرقية. تم تحديد إحداثيات مجسمة وفقا لأطلس الدماغ الماوس واختبارها عن طريق حقن 200 نانولتر من الفلورسنت التتبع فلورو ?…

Discussion

في الحقن الفيروسي في الجسم الحي للتعبير عن أوبسينات حساسة للضوء في منطقة الدماغ المحددة هو طريقة الاختيار للتحليل البصري للاتصال الوظيفي طويل المدى10،11،17،18. حقن مجسمة توفر إمكانية لاستهداف منطقة محددة من الدماغ على وج…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر برتراند ماثون، ميري نصار، لي وين هوانغ، وجان سيمونيت على مساعدتهم في تطوير الإصدارات السابقة من بروتوكول حقن المجسمة ومارين مانويل وباتريس جيغوزو للمساعدة التقنية. وقد دعمت هذا العمل وزارة التعليم والبحث الفرنسية (L.R., L.S.), Centre National des Etudes Spatiales (M.B.), and Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D.F.).

Materials

0.5 mm bur  Harvard Apparatus 724962
10 µL Hamilton syringe Hamilton 1701 RN – 7653-01
10X PBS solution Thermofisher Scientific AM9624  text
36% PFA Sigma-Aldrich F8775
470 nm LED  Cairn Research P1105/470/LED  DC/59022m use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP 
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Penn Vector Core AV-5-PV3446 lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 
All chemicals Sigma
Bath temperature controler Luigs & Neumann SM7 Set at 34°C 
beveled metal needle Hamilton 7803-05 33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors Dahle Allround 50038
Biocytin Sigma B4261 final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries Havard Apparatus GC150-10 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller Sutter Instruments P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack Thermofisher Scientific 28372
butterfly needle for perfusion Braun  Venofix A 24G
CCD Camera Andor  DL-604M
Confocal Microscope Zeiss LSM710 20X
curved forceps FST  11011-17
CY5 configuration (confocal) Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 
CY5 configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI Sigma D9542
DAPI configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A Axon Instruments
Digital handheld optical meter ThorLabs PM100D Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight Nightsea DFP-1 excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA Sigma E4368 final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse TE-2000E 10 or 20X
Filter paper Whatman
Fluoro-Ruby 10% Millipore AG335 disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate Physitemp HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml Sanofi 5 ml vial
HEPES Sigma H3375 final 10 mM
High speed rotary micromotor kit Foredom K.1070 maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator A-M Systems 2100
KCl Sigma P4504 final 1,2 mM
Ketamine 1000 Virbac
Ketofen 10% Merial 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine) MSD 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery Photonic (via Phymep) 10044
LED Power Supply Cairn Research OptoLED Light Source
Manipulators Luigs & Neumann SM-7
Mg-ATP 2H20 Sigma A9187 final 4 mM
MgCl2 Sigma 63069 final 2 mM
Micro temperature controler Physitemp MTC-1
Milk powder Carnation
MultiClamp 700B Axon Instruments
Na Phosphocreatine Sigma P7936 final 10 mM
Na3-GTP 2H20 Sigma G9002 final 0.4 mM
needle holder/hemostat FST 13005-14
pClamp acquisition software Axon Instruments
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3 14-16 on the display for 2-3 ml/min 
Potassium gluconate (K-gluconate) Sigma G4500 Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium Thermofisher Scientific P36390
Rompun 2% (xylazine) Bayer
small scissors FST 14060-09
Sodium chloride 0.9%  Virbac dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT VWR 630-1584
Stereotaxic frame with digital display Kopf Model 940 Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate Life technologies  434315
Streptavidin-Cy5 conjugate Thermofisher Scientific S32357
Superglue3 Loctite Dutscher 999227 1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid Ethicon F3210
Syringe pump kdScientific Legato 130 – 788130 Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer Leica VT1200S speed 0.07, amplitude 1.
tubing Gilson F117942, F117946 Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope Olympus BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper Nalgene

Referenzen

  1. Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
  2. Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
  3. Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
  4. Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
  5. Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
  6. Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
  7. Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
  8. Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
  9. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
  10. Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
  11. Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
  12. Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
  13. Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
  14. Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
  15. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
  16. Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
  17. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
  19. Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
  20. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
  21. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  22. Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).

View Video