In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injektionen für optogenetische Stimulation von Long-Range-Eingängen in Maus Gehirn Scheiben
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, um die zelltypspezifische funktionelle Konnektivität von Ferneingaben aus entfernten Hirnregionen mithilfe optogenetischer Stimulationen in ex vivo Gehirnscheiben zu identifizieren.
Abstract
Kenntnisse über zellspezifische synaptische Konnektivität sind eine entscheidende Voraussetzung für das Verständnis hirnbreiter neuronaler Schaltkreise. Die funktionelle Untersuchung von Fernverbindungen erfordert gezielte Aufnahmen einzelner Neuronen in Kombination mit der spezifischen Stimulation identifizierter entfernter Eingänge. Dies ist oft schwierig mit konventionellen und elektrischen Stimulationstechniken zu erreichen, da Axone aus konvergierenden vorgelagerten Hirnbereichen sich in der Zielregion vermischen können. Die stereotaxic-Targeting einer bestimmten Hirnregion für die virusvermittelte Expression lichtempfindlicher Ionenkanäle ermöglicht eine selektive Stimulation von Axonen aus dieser Region mit Licht. Intracerebrale stereotaxic Injektionen können in gut abgegrenzten Strukturen, wie die vorderen thalamic Kerne, zusätzlich zu anderen subkortikalen oder kortikalen Bereichen im gesamten Gehirn verwendet werden.
Beschrieben hier ist eine Reihe von Techniken für die präzise stereotaxic Injektion von viralen Vektoren, die Channelrhodopsin im Mausgehirn, gefolgt von Photostimulation von Axon-Terminals in der Gehirnscheibe Vorbereitung. Diese Protokolle sind einfach und weit verbreitet. In Kombination mit der Ganzzell-Patchklemmenaufzeichnung aus einem postsynaptisch verbundenen Neuron ermöglicht die Photostimulation von Axonen den Nachweis funktioneller synaptischer Verbindungen, die pharmakologische Charakterisierung und die Beurteilung ihrer Stärke. Darüber hinaus kann die Biozytinfüllung des aufgezeichneten Neurons zur post-hoc morphologischen Identifizierung des postsynaptischen Neurons verwendet werden.
Introduction
Die Definition der Konnektivität zwischen Hirnregionen ist notwendig, um neuronale Schaltkreise zu verstehen. Klassische anatomische Tracing-Methoden ermöglichen die Etablierung interregionaler Konnektivität, und Läsionsstudien helfen, die hierarchische Organisation des Informationsflusses zu verstehen. Zum Beispiel beinhalten Gehirnkreise für räumliche Orientierung und Kopfrichtungssignalisierung den Richtungsfluss von Informationen vom Thalamus zum Presubiculum. Dies wurde durch Läsionsstudien von antero-dorsalen thalamischen Kernen (ADN) nachgewiesen, die das Kopfrichtungssignal im nachgeschalteten dorsalen Presubiculum abbauen, sowie das parahippocampale Gitterzellsignal1,2.
Die funktionelle Konnektivität zwischen Hirnbereichen ist schwieriger auf zellulärer und subzellulärer Ebene zu etablieren. Im Hippocampus ermöglicht eine hochorganisierte Anatomie die Untersuchung von signalspezifischen synaptischen Verbindungen mittels elektrischer Simulation in der Scheibenpräparation. Stimulationselektroden, die in der Stratum radiatum von CA1 platziert werden, können gezielt verwendet werden, um den Schaffer-Kollateraleinsatz aus CA33gezielt zu stimulieren. Stimulierende Elektroden, die in Stratum lacunosum moleculare von CA1 platziert werden, aktivieren den perforanten Pfadeingang zu CA14,5. Elektrische Stimulation aktiviert Neurotransmitter Freisetzung von Axon-Terminals; es aktiviert jedoch Neuronen mit Somata in der Nähe der Stimulationsstelle sowie Axone der Passage. Es ist daher von begrenztem Nutzen für die Untersuchung von Afferents aus definierten Hirnregionen, wenn Fasern verschiedener Herkunftsregionen in der Zielstruktur verwechseln, wie es typischerweise im Neocortex der Fall ist.
Neuronen können auch mit Licht stimuliert werden. Optische Methoden umfassen die Photoaktivierung von Käfigglutamat, die mit ein- oder zweiphotonen Laserscanning kombiniert werden kann. Mehrere eng verteilte Stellen können sequenziell stimuliert werden, ohne mechanische Schäden am Gewebe6. Dies wurde erfolgreich verwendet, um synaptische Rezeptoren zu kartieren sowie einzelne Neuronen zu aktivieren7. Während Glutamat-Unkaging für die lokale Schaltungsanalyse verwendet werden kann, erlaubt es keine spezifische Aktivierung von Ferneingängen.
Eine Methode der Wahl für die Untersuchung der Langstreckenkonnektivität in neuronalen Schaltkreisen ist die Verwendung von virusvermittelter Kanalrhodopsin-Expression. Mit in vivo stereotaxic Injektionen, wie hier beschrieben, kann der Ausdruck von lichtgebundenen Ionenkanälen gezielt und räumlich auf eine gewünschte Hirnregion beschränkt werden. Auf diese Weise sind Kanalrhodopsine wirksam für die Kartierung erregender oder hemmender Konnektivität von einer Region zu ihrem Ziel. Transfizierte Axonklemmen können mit Licht in einer Gehirnscheibenpräparation stimuliert werden, und Patch-Clamp-Aufnahmen als Auslese ermöglichen die Untersuchung der Funktionen und Stärken bestimmter Schaltungskomponenten im Gehirn8. Der optogenetische Ansatz in Kombination mit der stereotaxic-Injektion eines Virus bietet eine beispiellose Spezifität und genetische Kontrolle9. Stimulieren mit Licht ermöglicht zusätzlich sowohl hohe zeitliche als auch räumliche Präzision10,11.
Das Presubiculum ist eine sechsschichtige kortikale Struktur am Übergang des Hippocampus und der Parahippocampusformation12,13. Es erhält wichtige synaptische Eingaben aus dem ADN11, aber auch aus mehreren anderen kortikalen und subkortikalen Regionen14. Somit ist die selektive Stimulation von thalamischen Axonklemmen innerhalb einer präsubikulären Scheibe weder mit elektrischer Stimulation noch mit Glutamat-Unkaging möglich. Beschrieben in diesem Protokoll sind Methoden zur Bestimmung der funktionellen Konnektivität zwischen Hirnregionen (ADN und Presubiculum) mithilfe präziser stereotaxic-Injektionen viraler Vektoren, die lichtgated Kanäle exdrücken. Ebenfalls beschrieben ist die Photostimulation von Axonen-Terminals von projizierten Neuronen in ihrer Zielregion, gekoppelt mit Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen von postsynaptischen Neuronen in der Hirnscheibenpräparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo virale Injektion, um lichtempfindliche Opsine in einem definierten Gehirnbereich auszudrücken, ist eine Wahlmethode für die optogenetische Analyse der langfristigen funktionellen Konnektivität10,11,17,18. Stereotaxie-Injektionen bieten die Möglichkeit, einen bestimmten Bereich des Gehirns genau anzusprechen. Die Koexpression eines Opsins mit einem fluoreszierenden Reporter ermöglic…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang und Jean Simonnet für ihre Hilfe bei der Entwicklung früherer Versionen des stereotaxic Injektionsprotokolls und Marin Manuel und Patrice Jegouzo für die technische Hilfe. Diese Arbeit wurde vom französischen Ministerium für Bildung und Forschung (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) und Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.) unterstützt.
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
Referenzen
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