In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato
Summary
Este protocolo descreve um conjunto de métodos para identificar a conectividade funcional específica do tipo de célula de entradas de longo alcance de regiões cerebrais distantes usando estimulações optogenéticas em fatias de cérebro ex vivo.
Abstract
O conhecimento da conectividade sináptica específica do tipo celular é um pré-requisito crucial para a compreensão de circuitos neuronais cerebrais. A investigação funcional de conexões de longo alcance requer gravações direcionadas de neurônios únicos combinados com a estimulação específica de entradas distantes identificadas. Isto é frequentemente difícil de conseguir com técnicas convencionais e elétricas da estimulação, porque os axônios das áreas ascendentes convergentes do cérebro podem misturar-se na região de alvo. A segmentação estereotaxica de uma região cerebral específica para a expressão mediada por vírus de canais iônicos sensíveis à luz permite a estimulação seletiva de axônios originários daquela região com luz. As injeções Stereotaxic intracerebral podem ser usadas em estruturas bem delimitadas, tais como os núcleos thalamic anteriores, além do que outras áreas subcortical ou corticais durante todo o cérebro.
Descrito aqui é um conjunto de técnicas para a injeção estereotaxica precisa de vetores virais expressando channelrhodopsina no cérebro do rato, seguido por fotoestimulação de terminais AXON na preparação fatia do cérebro. Esses protocolos são simples e amplamente aplicáveis. Em combinação com a gravação da braçadeira de remendo da todo-pilha de um Neuron pós-sinapticamente conectado, o photoestimulação dos axônios permite a deteção de conexões sináptica funcionais, de caracterização farmacológica, e de avaliação de sua força. Além, o enchimento do biocytin do neurônio gravado pode ser usado para a identificação morfológica post-hoc do neurônio pós-sináptica.
Introduction
A definição de conectividade entre regiões cerebrais é necessária para compreender os circuitos neurais. Os métodos anatômicos de traçado clássicos permitem estabelecer a conectividade inter-regional, e os estudos da lesão ajudam a compreender a organização hierárquica do fluxo de informação. Por exemplo, os circuitos cerebrais para a orientação espacial e a sinalização do sentido da cabeça envolvem o fluxo direcional da informação do tálamo ao presubiculum. Isto foi demonstrado por estudos de lesão de núcleos talâmicos Antero-dorsais (ADN) que degradam o sinal de direção da cabeça no presubiculum dorsal a jusante, bem como osinal de célulade grade hipocampal1,2.
A conectividade funcional entre as áreas cerebrais é mais difícil de estabelecer a nível celular e subcelular. No hipocampo, uma anatomia altamente organizada permite investigar conexões sinápticas via-específicas usando simulação elétrica na preparação da fatia. Eletrodos de estimulação colocados no radiatum de estrato de CA1 podem ser usados para estimular especificamente a entrada colateral de Schaffer de3a. Estimular eletrodos colocados em estrato lacunosum moleculare de CA1 ativará a entrada derivação caminho para CA14,5. A estimulação elétrica ativa a liberação do neurotransmissor dos terminais do AXON; no entanto, ele ativa os neurônios com SOMATA perto do local de estimulação, bem como axônios de passagem. É, portanto, de uso limitado para estudar aferentes de regiões cerebrais definidas quando fibras de diferentes regiões de origem se misturam na estrutura-alvo, como é tipicamente o caso no neocórtex.
Os neurônios também podem ser estimulados com a luz. Os métodos ópticos incluem a fotoativação do glutamato enjaulado, que pode ser combinada com a digitalização a laser de um ou dois fótons. Vários locais com espaçamento próximo podem ser estimulados sequencialmente, sem danos mecânicos ao tecido6. Isso foi usado com sucesso para mapear os receptores sinápticos, bem como ativar os neurônios individuais7. Quando o glutamato que uncaging puder ser usado para a análise de circuito local, não permite a ativação específica de entradas de longo alcance.
Um método de escolha para a investigação da conectividade de longo alcance em circuitos neuronais é o uso da expressão de channelrhodopsina mediada por vírus. Usando injeções estereotaxicas in vivo como descrito aqui, a expressão de canais iônicos leves pode ser direcionada e espacialmente restrita a uma região cerebral desejada. Desta forma, channelrhodopsins são eficazes para mapear a conectividade excitatória ou inibitório de uma região para o seu alvo. Os terminais dos axônios transfected podem ser estimulados com luz em uma preparação da fatia do cérebro, e as gravações da remendo-braçadeira como uma leitura-para fora permitem o exame das funções e dos pontos fortes de componentes específicos do circuito no cérebro8. A aproximação optogenética combinada com a injeção Stereotaxic de um vírus oferece a especificidade sem precedentes e o controle genético9. Estimular com luz Adicionalmente permite a precisão temporal e espacial elevada10,11.
O presrubiculum é uma estrutura cortical de seis camadas na transição do hipocampo e a formação para-hippocampal12,13. Recebe a entrada sináptica importante do ADN11 mas também de diversas outras regiões corticais e subcortical14. Assim, a estimulação seletiva de terminais thalamic dos axônios dentro de uma fatia presubicular não é possível com estimulação elétrica nem glutamato uncaging. Descritos neste protocolo são métodos para determinar a conectividade funcional entre as regiões cerebrais (ADN e presubiculum) usando injeções estereotaxicas precisas de vetores virais expressando canais de luz bloqueada. Também descrito é a fotoestimulação dos terminais de axônios de projetar neurônios em sua região-alvo, juntamente com gravações de patch-Clamp de células inteiras de neurônios pós-sinápticos na preparação da fatia cerebral.
Protocol
Representative Results
Discussion
A injeção viral in vivo para expressar opsinas sensíveis à luz em uma área cerebral definida é um método de escolha para a análise optogenética da conectividade funcional de longo alcance10,11,17,18. As injeções Stereotaxic oferecem a possibilidade para alvejar precisamente uma área específica do cérebro. A coexpressão de um opsina com um repórter fluorescente permite convenient…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Bertrand Mathon, Mérie Nassar, li-Wen Huang, e Jean Simonnet por sua ajuda no desenvolvimento de versões anteriores do protocolo de injeção estereotótaxica e Marin Manuel e Patrice Jegouzo para obter ajuda técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério francês da educação e investigação (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.), e Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
Referenzen
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