In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo
Summary
Questo protocollo descrive una serie di metodi per identificare la connettività funzionale specifica del tipo di cellula degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando stimolazioni optogenetiche in fette cerebrali ex vivo.
Abstract
La conoscenza della connettività sinaptica specifica di tipo cellulare è un prerequisito fondamentale per comprendere i circuiti neuronali a livello di cervello. Lo studio funzionale delle connessioni a lungo raggio richiede registrazioni mirate di singoli neuroni combinati con la stimolazione specifica di input distanti identificati. Questo è spesso difficile da ottenere con tecniche di stimolazione convenzionali ed elettriche, perché gli assoni provenienti da aree cerebrali a monte convergenti possono mescolarsi nella regione bersaglio. Il targeting stereotassico di una regione cerebrale specifica per l’espressione mediata da virus dei canali ionici sensibili alla luce consente una stimolazione selettiva degli assoni provenienti da quella regione con la luce. Le iniezioni stereotassiche intracerebrali possono essere utilizzate in strutture ben delimitate, come i nuclei talamici anteriori, oltre ad altre aree subcorticali o corticali in tutto il cervello.
Descritto qui è un insieme di tecniche per l’iniezione stereotassica precisa di vettori virali che esprimono channelrhodopsin nel cervello del topo, seguita da fotostimolazione dei terminali assoni nella preparazione della fetta del cervello. Questi protocolli sono semplici e ampiamente applicabili. In combinazione con la registrazione di morsetto di cervo a tutta cellula da un neurone postsynaptaptically collegato, la fotostimolazione degli assoni consente il rilevamento di connessioni sinaptiche funzionali, la caratterizzazione farmacologica e la valutazione della loro forza. Inoltre, il riempimento della biocitina del neurone registrato può essere utilizzato per l’identificazione morfologica post-hoc del neurone post-sinaptico.
Introduction
La definizione della connettività tra le regioni del cervello è necessaria per comprendere i circuiti neurali. I classici metodi di tracciamento anatomico consentono di stabilire la connettività interregionale e gli studi di lesione aiutano a comprendere l’organizzazione gerarchica del flusso di informazioni. Ad esempio, i circuiti cerebrali per l’orientamento spaziale e la segnalazione della direzione della testa coinvolgono il flusso direzionale di informazioni dal talamo al presubiculum. Ciò è stato dimostrato da studi di lesioni di nuclei talamici cioco-dorsalici (ADN) che degradano il segnale di direzione della testa nel presubiculum dorsale a valle, così come il segnale della rete della griglia paraippocampale1,2.
La connettività funzionale tra le aree del cervello è più difficile da stabilire a livello cellulare e subcellulare. Nell’ippocampo, un’anatomia altamente organizzata permette di studiare le connessioni sinaptiche specifiche del percorso utilizzando la simulazione elettrica nella preparazione della fetta. Gli elettrodi di stimolazione collocati nel radiato stratificato di CA1 possono essere utilizzati specificamente per stimolare l’input collaterale di Schaffer da CA33. Stimolando gli elettrodi collocati nella molecolare di lacunoso stratificante di CA1 attiverà l’ingresso del percorso perforante a CA14,5. La stimolazione elettrica attiva il rilascio del neurotrasmettitore dai terminali assoni; tuttavia, attiva i neuroni con somata vicino al sito di stimolazione e assoni di passaggio. È quindi di uso limitato per studiare gli afferenti da regioni cerebrali definite quando le fibre di diverse regioni di origine si mescolano nella struttura bersaglio, come è tipicamente il caso nella neocorteccia.
I neuroni possono anche essere stimolati con la luce. I metodi ottici includono la fotoattivazione del glutammato in gabbia, che può essere combinato con la scansione laser a uno o due fotoni. Più siti strettamente distanziati possono essere stimolati in sequenza, senza danni meccanici al tessuto6. Questo è stato utilizzato con successo per mappare i recettori sinaptici così come attivare i singoli neuroni7. Mentre lo sblocco del glutammato può essere utilizzato per l’analisi del circuito locale, non consente l’attivazione specifica di input a lungo raggio.
Un metodo di scelta per lo studio della connettività a lungo raggio nei circuiti neuronali è l’uso dell’espressione channelrhodopsin mediata da virus. Utilizzando iniezioni stereotassiche in vivo come descritto qui, l’espressione dei canali ionici illuminati può essere mirata e limitata spazialmente a una regione del cervello desiderata. In questo modo, le channelrhodopsins sono efficaci per mappare la connettività eccitatoria o inibitoria da una regione al suo obiettivo. I terminali degli assoni transettati possono essere stimolati con la luce nella preparazione di una fetta di cervello, e le registrazioni patch-clamp come una lettura consente l’esame delle funzioni e dei punti di forza di specifici componenti del circuito nel cervello8. L’approccio optogenetico combinato con l’iniezione stereotassica di un virus offre una specificità senza precedenti e il controllo genetico9. La stimolazione con la luce consente inoltre un’elevata precisione temporale che spaziale10,11.
Il presubiculum è una struttura corticale a sei strati alla transizione dell’ippocampo e della formazione para-ippocampale12,13. Riceve un importante input sinaptico dall’ADN11 ma anche da diverse altre regioni corticali e subcorticali14. Pertanto, la stimolazione selettiva dei terminali degli assoni talamici all’interno di una fetta presubicolare non è possibile con la stimolazione elettrica né con lo sblocco del glutammato. Descritto in questo protocollo sono metodi per determinare la connettività funzionale tra le regioni del cervello (ADN e presubiculum) utilizzando precise iniezioni stereotassiche di vettori virali che esprimono canali illuminati. È stata descritta anche la fotostimolazione dei terminali degli assoni dei neuroni proiettanti nella loro regione bersaglio, insieme alle registrazioni a morsetto a tutta cellula dei neuroni post-sinaptici nella preparazione delle fette cerebrali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’iniezione virale in vivo per esprimere le opsine sensibili alla luce in un’area del cervello definita è un metodo di scelta per l’analisi optogenetica della connettività funzionale a lungo raggio10,11,17,18. Le iniezioni stereotassiche offrono la possibilità di indirizzare con precisione una specifica area del cervello. La coespressione di un opsino con un reporter fluorescente permette co…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang e Jean Simonnet per il loro aiuto nello sviluppo di versioni precedenti del protocollo di iniezione stereotassico e Marin Manuel e Patrice Jegouzo per l’aiuto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero francese per l’istruzione e la ricerca (L. R., L. S.), Centro Nazionale di Des Etudes Spatiales (M. B.), e Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
Referenzen
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