Summary

비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

Published: September 17, 2010
doi:

Summary

이 프로토콜은 살아있는 쥐 두뇌의 특정 영역에 유전자 구성의 제공이 아닌 바이러스 방법을 설명합니다. 방법은 플라스미드 준비, micropipette 제조, 신생아 쥐 새끼 수술, 구조의 microinjection과로 구성되어 있습니다<em> 생체내에</em> electroporation.

Abstract

유전자 변형 동물의 창조는 생체내에 대한 관심의 유전자의 기능을 연구의 표준 방법입니다. 그러나 대부분의 녹아웃이나 유전자 변형 동물은 수정 유전자가 표현하거나 전체 유기체에서 삭제됩니다 이러한 경우에는 가능한하지 않습니다. 또한, 보상 메커니즘의 다양한 종종 어려운 결과를 해석하는 있도록. 보상 효과는 어느 타이밍 유전자 발현이나 transfected 세포의 양을 제한하여 완화된 수 있습니다.

출생 후의 비 심실 microinjection 및 생체내의 electroporation의 방법은 직접 신생아 쥐 두뇌에 대한 관심의 작은 지역으로 유전자, siRNA 또는 염료 분자 타겟으로 배달을 허용합니다. 기존의 심실 사출 기술에 대조적으로,이 방법 이외의 철새 세포 유형의 transfection 수 있습니다. 방법 여기에서 설명한 방식으로 transfected 동물 생체내 이미징이나 급성 뇌 조각에 electrophysiological 실험에서 두 광자에 대한 예를 들어, 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 소개 유전자 변형 동물의 창조 동물 1 생활과 무너지고 질병 메커니즘 2,3뿐만 아니라 세포 4 속성을 조작을위한 유전자 기능 조사의 강력한 방법입니다. 그러나, 절차 따라서 이러한 바이러스 주사 5, electroporation 6과 utero electroporation 7,8에서 신생아 심실 주입과 같은 다른 유전자 전달 방법의 사용을 warranting, 매?…

Discussion

생활 쥐 두뇌에 유전자 전달 방법은 잘 출생 후의 electroporation 6보다 최근 utero electroporation 7,8,11,12에 대한 설립하고 있습니다. 그러나 이러한 방법은 여러 어플 리케이션에 제한 수있는 플라스미드 DNA의 심실 주사를 기반으로합니다. 예를 들어, 이러한 방법은 해마, 대뇌 피질이나 ast​​rocytes 같은 비 철새 세포 유형의 transfection와 같은 특정 뇌 영역에서 세포를 대상?…

Acknowledgements

우리는 비디오 사운드 트랙 녹음, 전투 편대 – EGFP 플라스미드 준비 3D 애니메이션 박사 피터 Blaesse에 대한 이반 Molotkov와 관련하여 도움이 예카 Karelina 감사합니다.

작품은 핀란드의 국제 이동성, 핀란드어 문화 재단과 핀란드의 아카데미의 센터에서 부여에 의해 지원되었다.

Materials

Material Name Typ Company Catalogue Number Comment
2A-sa dumb Tweezers, 115mm equipment XYtronic XY-2A-SA Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad equipment Supertech TMP-5b  
Borosilicate tube with filament material Sutter Instruments BF120-69-10 Glass needle
Disposable drills material Meisinger HP 310 104 001 001 008  
Dulbeco’s PBS 10X reagent Sigma D1408  
Dumont #5 forceps, 110 mm equipment FST 91150-20 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Ealing microelectrode puller equipment Ealing 50-2013 Vertical electrode glass puller
Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c material Johnson & Johnson Medical EH7177H Surgical threads
Exmire micro syringe 10.0 ml equipment Exmire MS*GLLX00 Gas-tight syringe
Fast Green reagent Sigma F7252  
Forceps electrodes equipment BEX LF650P3 Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use
Foredom drill control equipment Foredom FM3545 Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Foredom micro motor handpiece equipment Foredom MH-145 Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Gas anesthesia platform for mice equipment Stoelting 50264 Assembled on stereotaxic instrument
Isoflurane reagent Baxter FDG9623  
Micro dressing forceps, 105 mm equipment Aesculap BD302R Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Microfil material WPI MF34G-5 Micro syringe filling capillaries
Mineral oil reagent Sigma M8410  
NanoFil Syringe 10 microliter equipment WPI NANOFIL Hamilton syringe
plasmid CAG-EGFP reagent     Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml
Pulse generator CUY21Vivo-SQ equipment BEX CUY21Vivo-SQ  
Schiller electrode gel reagent Schiller AG 2.158000 Conductive gel
Small animal stereotaxic instrument equipment David Kopf Instruments 900  
Stoelting mouse and neonatal rat adaptor equipment Stoelting 51625 Assembled on stereotaxic instrument. Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Student iris scissors, straight 11.5 cm equipment FST 91460-11 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm material Kettenbach 31602 Surgical tampons
UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller equipment WPI UMP3-1 Microinjector and controller
Univentor 400 Anesthesia Unit equipment Univentor 8323001  

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation. J. Vis. Exp. (43), e2244, doi:10.3791/2244 (2010).

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