Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação
Summary
Este protocolo descreve um método não-viral de entrega de construções genéticas para uma determinada área do cérebro de roedores vivos. O método consiste na preparação de plasmídios, fabricação micropipeta, a cirurgia de rato neonatal filhote, microinjeção da construção, e<em> In vivo</em> Eletroporação.
Abstract
Criação de animais transgênicos é uma abordagem padrão no estudo de funções de um gene de interesse in vivo. No entanto, muitos knockout ou animais transgênicos não são viáveis nos casos em que o gene modificado ou excluído é expressa em todo o organismo. Além disso, uma variedade de mecanismos compensatórios, muitas vezes dificultam a interpretação dos resultados. Os efeitos compensatórios podem ser atenuadas por qualquer tempo a expressão de genes ou limitar a quantidade de células transfectadas.
O método de microinjeção ventricular não-pós-natal e no eletroporação in vivo permite entrega prevista para genes, moléculas de corante siRNA ou diretamente a uma pequena região de interesse no cérebro de roedores recém-nascidos. Em contraste com a técnica convencional de injeção ventricular, este método permite a transfecção de tipos de células não-migratórias. Transfectadas animais por meio do método descrito aqui pode ser usado, por exemplo, por dois fótons de imagem in vivo ou em experimentos eletrofisiológicos em fatias cerebral aguda.
Protocol
Discussion
Métodos de entrega de gene no cérebro de roedores vivos estão bem estabelecidos no utero eletroporação 7,8,11,12 e, mais recentemente, por eletroporação pós-natal 6. No entanto, esses métodos são baseados em injeção intraventricular do DNA plasmídeo, que pode ser limitante para diversas aplicações. Por exemplo, estes métodos não permitem a segmentação células em certas áreas do cérebro, como hipocampo, nem a transfecção de tais tipos de células não-migratórias co…
Acknowledgements
Agradecemos a Ekaterina Karelina ajuda com gravação de trilha sonora para o vídeo, Ivan Molotkov para animação 3D e Dr. Peter Blaesse para CAG-EGFP preparação plasmídeo.
O trabalho foi suportado por concessões do Centro de Mobilidade Internacional da Finlândia, da Fundação Cultural da Finlândia e da Academia da Finlândia.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | equipment | XYtronic | XY-2A-SA | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | equipment | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilicate tube with filament | material | Sutter Instruments | BF120-69-10 | Glass needle |
| Disposable drills | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | reagent | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | equipment | FST | 91150-20 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Ealing microelectrode puller | equipment | Ealing | 50-2013 | Vertical electrode glass puller |
| Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson & Johnson Medical | EH7177H | Surgical threads |
| Exmire micro syringe 10.0 ml | equipment | Exmire | MS*GLLX00 | Gas-tight syringe |
| Fast Green | reagent | Sigma | F7252 | |
| Forceps electrodes | equipment | BEX | LF650P3 | Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use |
| Foredom drill control | equipment | Foredom | FM3545 | Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom micro motor handpiece | equipment | Foredom | MH-145 | Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Gas anesthesia platform for mice | equipment | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Isoflurane | reagent | Baxter | FDG9623 | |
| Micro dressing forceps, 105 mm | equipment | Aesculap | BD302R | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Microfil | material | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | reagent | Sigma | M8410 | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | equipment | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| plasmid CAG-EGFP | reagent | Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml | ||
| Pulse generator CUY21Vivo-SQ | equipment | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller electrode gel | reagent | Schiller AG | 2.158000 | Conductive gel |
| Small animal stereotaxic instrument | equipment | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | equipment | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | equipment | FST | 91460-11 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Surgical tampons |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | equipment | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Univentor 400 Anesthesia Unit | equipment | Univentor | 8323001 |
Referenzen
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