Гена Доставка в послеродовой мозга крысы по Non-желудочковой плазмиды инъекция и Электропорация
Summary
Этот протокол описывает невирусных способ доставки генетических конструкций в определенной области живой мозг грызуна. Метод состоит из плазмиды подготовки, микропипетки изготовления, новорожденных крысят хирургии, микроинъекции построить, и<em> В естественных условиях</em> Электропорации.
Abstract
Создание трансгенных животных является стандартным подходом в изучении функции гена в живом организме. Однако многие нокаутом или трансгенных животных, не являются жизнеспособными в тех случаях, когда изменение ген экспрессируется или удалены во всем организме. Более того, различные компенсаторные механизмы часто затрудняют интерпретацию результатов. Компенсационных эффектов можно избежать, либо сроках экспрессии генов или ограничение количества трансфекции клеток.
Метод постнатального не-желудочковой микроинъекции и в естественных условиях электропорация позволяет адресной доставки генов, миРНК или молекул красителя непосредственно в небольшой области интереса к новорожденному мозга грызунов. В отличие от обычной техники инъекции желудочка, этот метод позволяет трансфекции немигрирующих типов клеток. Животные трансфекции с помощью метода, описанного здесь, может использоваться, например, для двухфотонного в естественных изображений или в электрофизиологических экспериментах на острые ломтики мозга.
Protocol
Discussion
Методы доставки генов в живой мозг грызуна, хорошо известны за внутриутробно электропорации 7,8,11,12 и, совсем недавно, в послеродовом электропорации 6. Однако, эти методы основаны на внутрижелудочкового введения плазмидной ДНК, которые могут быть предельными для несколь…
Acknowledgements
Мы благодарим Екатерина Карелина на помощь с саундтреком для записи видео, Иван Молотков для 3D-анимации и д-р Питер Blaesse для CAG-EGFP плазмидной ДНК.
Работа выполнена при поддержке грантов от центра международной мобильности Финляндии, финский культурный фонд и Академия Финляндии.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | equipment | XYtronic | XY-2A-SA | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | equipment | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilicate tube with filament | material | Sutter Instruments | BF120-69-10 | Glass needle |
| Disposable drills | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | reagent | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | equipment | FST | 91150-20 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Ealing microelectrode puller | equipment | Ealing | 50-2013 | Vertical electrode glass puller |
| Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson & Johnson Medical | EH7177H | Surgical threads |
| Exmire micro syringe 10.0 ml | equipment | Exmire | MS*GLLX00 | Gas-tight syringe |
| Fast Green | reagent | Sigma | F7252 | |
| Forceps electrodes | equipment | BEX | LF650P3 | Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use |
| Foredom drill control | equipment | Foredom | FM3545 | Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom micro motor handpiece | equipment | Foredom | MH-145 | Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Gas anesthesia platform for mice | equipment | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Isoflurane | reagent | Baxter | FDG9623 | |
| Micro dressing forceps, 105 mm | equipment | Aesculap | BD302R | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Microfil | material | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | reagent | Sigma | M8410 | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | equipment | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| plasmid CAG-EGFP | reagent | Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml | ||
| Pulse generator CUY21Vivo-SQ | equipment | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller electrode gel | reagent | Schiller AG | 2.158000 | Conductive gel |
| Small animal stereotaxic instrument | equipment | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | equipment | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | equipment | FST | 91460-11 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Surgical tampons |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | equipment | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Univentor 400 Anesthesia Unit | equipment | Univentor | 8323001 |
Referenzen
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer’s disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
- Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
- Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
- Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
- Ashwell, K., Paxinos, G. . Atlas of the Developing Rat Nervous System. , (2008).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2007).
