ג'ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה שאינה ויראלי מסירת בונה גנטית באזור מסוים של המוח מכרסם החי. השיטה מורכבת הכנה פלסמיד, ייצור micropipette, ניתוח חולדה בילוד הגור, microinjection של לבנות, ואת<em> In vivo</em> Electroporation.
Abstract
יצירת חיות טרנסגניות היא הגישה הסטנדרטית בלימוד פונקציות של הגן של עניין in vivo. עם זאת, רבים בנוקאאוט או חיות טרנסגניות אינם קיימא באותם מקרים שבהם הגן מתבטא שונה או נמחק בתוך האורגניזם כולו. יתר על כן, מגוון של מנגנוני פיצוי לעתים קרובות לעשות את זה קשה לפרש את התוצאות. ההשפעות הפיצוי ניתן להקל על ידי תזמון גם את ביטוי הגנים או להגביל את כמות התאים transfected.
שיטת microinjection חדרית בלתי הלידה והן electroporation vivo מאפשר משלוח ממוקד של גנים, siRNA או מולקולות צבען ישירות באזור קטן של עניין במוח מכרסם היילוד. בניגוד הטכניקה המקובלת חדרית הזרקה, שיטה זו מאפשרת transfection שאינם נודדים סוגי תאים. בעלי חיים transfected באמצעות השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש, למשל, עבור שני הפוטונים in vivo הדמיה או בניסויים אלקטרו על פרוסות המוח חריפה.
Protocol
Discussion
דרכי המסירה הגן לתוך המוח מכרסם החי מבוססים היטב עבור ברחם electroporation 7,8,11,12, ולאחרונה, עבור electroporation הלידה 6. עם זאת, שיטות אלו מבוססות על הזרקה תוך חדרי של ה-DNA פלסמיד, שיכולה להיות המגביל את מספר יישומים. לדוגמה, שיטות אלו אינן מאפשרות מיקוד תאים באזורים ?…
Acknowledgements
אנו מודים יקטרינה Karelina לעזרה עם הקלטת פסקול וידאו, איוון Molotkov עבור 3D אנימציה ד"ר פיטר Blaesse להכנת החטיבה-EGFP פלסמיד.
העבודה נתמכה על ידי מענקים ממרכז הניידות של הבינלאומי של פינלנד, קרן התרבות הפינית האקדמיה של פינלנד.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | equipment | XYtronic | XY-2A-SA | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | equipment | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilicate tube with filament | material | Sutter Instruments | BF120-69-10 | Glass needle |
| Disposable drills | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | reagent | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | equipment | FST | 91150-20 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Ealing microelectrode puller | equipment | Ealing | 50-2013 | Vertical electrode glass puller |
| Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson & Johnson Medical | EH7177H | Surgical threads |
| Exmire micro syringe 10.0 ml | equipment | Exmire | MS*GLLX00 | Gas-tight syringe |
| Fast Green | reagent | Sigma | F7252 | |
| Forceps electrodes | equipment | BEX | LF650P3 | Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use |
| Foredom drill control | equipment | Foredom | FM3545 | Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom micro motor handpiece | equipment | Foredom | MH-145 | Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Gas anesthesia platform for mice | equipment | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Isoflurane | reagent | Baxter | FDG9623 | |
| Micro dressing forceps, 105 mm | equipment | Aesculap | BD302R | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Microfil | material | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | reagent | Sigma | M8410 | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | equipment | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| plasmid CAG-EGFP | reagent | Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml | ||
| Pulse generator CUY21Vivo-SQ | equipment | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller electrode gel | reagent | Schiller AG | 2.158000 | Conductive gel |
| Small animal stereotaxic instrument | equipment | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | equipment | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | equipment | FST | 91460-11 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Surgical tampons |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | equipment | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Univentor 400 Anesthesia Unit | equipment | Univentor | 8323001 |
Referenzen
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer’s disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
- Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
- Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
- Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
- Ashwell, K., Paxinos, G. . Atlas of the Developing Rat Nervous System. , (2008).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2007).
