O presente protocolo descreve a geração de Drosophila melanogaster expressando opsinas eNpHR2.0 ou ReaChR no coração para imagem OCT e ritmo cardíaco optogenético. Instruções detalhadas para imagem de Drosophila OCT e modulação de batimentos cardíacos, incluindo a simulação de parada cardíaca restauradora, bradicardia e taquicardia em animais vivos em diferentes estágios de desenvolvimento, são relatadas.
O uso de Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas) como organismo modelo tem garantido progressos significativos em muitas áreas da ciência biológica, desde organização celular e investigações genômicas até estudos comportamentais. Devido ao conhecimento científico acumulado, nos últimos anos, drosophila foi trazida para o campo da modelagem de doenças humanas, incluindo distúrbios cardíacos. O trabalho apresentado descreve o sistema experimental de monitoramento e manipulação da função cardíaca no contexto de todo um organismo vivo utilizando luz vermelha (617 nm) e sem procedimentos invasivos. O controle sobre o coração foi alcançado usando ferramentas optogenéticas. A optogenética combina a expressão de opsinas transgênicas sensíveis à luz e sua ativação óptica para regular o tecido biológico de interesse. Neste trabalho, foi utilizada uma tomografia de coerência óptica integrada personalizada (OCT) e um sistema de estimulação optogenética para visualizar e modular o coração D. melanogaster em funcionamento nos estágios larval e de desenvolvimento pupal instar. O sistema genético duplo UAS/GAL4 foi empregado para expressar halorhodopsina (eNpHR2.0) e channelrhodopsin de mudança vermelha (ReaChR), especificamente no coração de mosca. São fornecidos detalhes sobre a preparação de D. melanogaster para imagens de OCT ao vivo e ritmo optogenético. Um software de integração desenvolvido em laboratório processou os dados de imagem para criar apresentações visuais e características quantitativas da função cardíaca Drosophila . Os resultados demonstram a viabilidade de iniciar parada cardíaca e bradicardia causada pela ativação do eNpHR2.0 e pela realização do ritmo cardíaco após a ativação do ReaChR.
No final de 2010, a revista Nature Methods selecionou a optogenética como o Método do Ano1. O uso de ferramentas genéticas (opsinas transgênicas) reguladas pela luz para controlar tecidos biológicos de interesse com precisão e velocidade sem precedentes abriu um portão de inundação para novas aplicações. Até o momento, a maioria das realizações pertence à neurociência. A tecnologia foi introduzida como um novo método de controle preciso de neurônios únicos2 e avançou para descobertas na área de funções cognitivas do organismo vivo3. Desde o início, os neurocientistas demonstraram a capacidade de modular todo o comportamento do organismo. A expressão e a ativação da luz da osina ChR2 em camundongos neurônios dopaminérgicos causaram sua ativação e foram suficientes para conduzir o condicionamento comportamental4. A inibição optogenética de um subconjunto de neurônios contendo halorhodopsina NpHR2.0 entregue ao foco epiléptico do cérebro de roedor resultou na atenuação de convulsões eletroencefalográficas5.
Aplicações optogenéticas em cardiologia estão se desenvolvendo a um ritmo constante6. O ChR2 foi expresso com sucesso na cultura celular cardiomiócitos e em camundongos; o ritmo cardíaco foi conduzido por flashes de luz azul (realizados utilizando uma fibra implantada em animais vivos)7. Em zebrafish, ChR2 foi expressa e usada para identificar a região cardíaca que faz o ritmo; Ativação NPHR induziu parada cardíaca8. O ritmo cardíaco optogenético tem o potencial único para desenvolver novas terapias de ritmo e ressincronização9. Tentativas de estabelecer um sistema de rescisão de arritmia autógena foram relatadas recentemente também10.
Pesquisas extensivas e o desenvolvimento de novos tratamentos terapêuticos requerem a aplicação de vários sistemas modelo, da cultura celular aos mamíferos. O coração de um vertebrado é um órgão muito complexo. Os cardiomiócitos (CM) compreendem um terço de todas as células cardíacas; outras células incluem neurônios, células musculares lisas vasculares e células não excitáveis (ou seja, células endoteliais, fibroblastos e células imunes). Pesquisar a cultura celular cm limita a tradução dos resultados obtidos para aplicações médicas humanas. As manipulações genéticas dos organismos de modelos mamíferos são limitadas e demoradas. Modelos invertebrados menores têm muitas vantagens; seu sistema cardiovascular carrega todos os elementos histológicos essenciais. Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas) é um sistema de modelo genético simples e poderoso para investigar o papel dos genes associados às doenças humanas, incluindo doenças cardíacas 11,12,13. Como animais de curta duração, as moscas-das-frutas representam uma excelente oportunidade para modelar mudanças de função cardíaca dependentes da idade ou da doença que podem ser traçadas ao longo da vida 14,15,16,17. O tubo cardíaco da mosca-das-frutas está localizado no lado dorsal de seu corpo dentro de 200 μm da superfície da cutícula, permitindo que a luz visível até quase infravermelha chegue ao tubo cardíaco. Este recurso anatômico permite o ritmo óptico não invasivo do coração Drosophila usando ferramentas optogenéticas existentes.
Para monitorar o coração Drosophila, foi desenvolvido um sistema de imagem de coerência óptica de domínio espectral personalizado (SD-OCT) com um módulo de excitação LED de luz vermelha integrada18. Alterações morfológicas e rítmicas em um coração de mosca de frutas relativamente simples podem ser facilmente analisadas com esta tecnologia de imagem biomédica não invasiva 12,19,20,21. Com desempenho de secção óptica aprimorada e resolução espacial em escala de micron, o OCT tem sido usado com sucesso para investigar a estrutura e monitorar a função do coração Drosophila em diferentes estágios de desenvolvimento, incluindo a 3ª larva instar e a pupaprecoce 18. Este sistema também permite o monitoramento simultâneo e estimulação da condição cardíaca da Drosophila no animal intacto. Uma visão esquemática do sistema OCT é mostrada na Figura 1. O sistema SD-OCT usa um diodo superluminescente (SLD) como fonte de luz (comprimento de onda central: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, ver Tabela de Materiais). Usando uma lente objetiva de 10x, o sistema de imagem OCT pode alcançar uma resolução axial de ~4,4 μm no ar e ~3,3 μm em tecido e uma resolução lateral de ~2,8 μm, suficiente para resolver detalhes finos das estruturas cardíacasde mosca 18,22. Sinais de interferência da luz refletida do braço de referência e do braço de amostra são detectados usando um espectrômetro com uma câmera de varredura de linha de 2048 pixels (taxa de linha máxima: 80 kHz, ver Tabela de Materiais). A sensibilidade do sistema medido é de ~95,1 dB. Cada varredura de OCT no modo B gera uma imagem transversal no plano de imagem xz. Imagens repetidas do modo B são adquiridas no mesmo local para criar imagens no modo M capturando o coração pulsante por mais de ~30 s 18,22,23. A taxa de quadros para imagens do modo M é de ~125 quadros/s, suficiente para capturar a dinâmica de bater coração de mosca de frutas.
Para a regulação optogenética da função cardíaca Drosophila , um módulo de iluminação com uma fonte de luz LED de 617 nm é integrado com o braço amostral do sistema SD-OCT. A luz de estimulação é focada em um ponto de ~2,2 mm de diâmetro na superfície da amostra, na mesma posição que o ponto de foco de imagem. Um software personalizado é utilizado para controlar o modo de iluminação (intensidade de luz, largura de pulso e ciclo de dever), ajustar a frequência de estimulação do pulso de luz e sincronizar a iluminação do módulo LED e a aquisição de imagens OCT do modo M22.
Publicações recentes descreveram o sistema transgênico Drosophila consistindo de operações chr2, ReaChR e eNpHR2.0 com o sistema genético UAS/GAL4. Os resultados obtidos demonstraram a capacidade de iniciar a parada cardíaca e a bradicardia causada pela ativação da luz vermelha do eNpHR2.0 e pelo ritmo cardíaco de maior frequência causado pela ativação da luz azul do ChR2. Experimentos semelhantes de ritmo foram realizados com outro channelrhodopsin, ReaChR, induível pela iluminação da luz vermelha 22,23,24. A expressão da osina em todos os experimentos descritos foi impulsionada pelo 24B-GAL4, onde a expressão da opsina foi observada em uma ampla gama de tecidos, incluindo cardiomiócitos e células musculares circundantes. No presente estudo, o 24B-GAL4 foi substituído por um driver Hand-GAL4 para alcançar a expressão de opsinas eNpHR2.0 e ReaChR específicas.
No geral, os resultados experimentais apresentados demonstram a parada cardíaca restauradora e as condições cardíacas indutíveis de bradicardia e taquicardia. Um protocolo detalhado com instruções passo a passo sobre a criação de modelos transgênicos de Drosophila e a realização de experimentos simultâneos de imagem e ritmo optogenético em animais vivos é fornecido.
Em comparação com nossos relatórios anteriores, onde a expressão das opsinas foi conduzida não apenas no coração, mas também nos tecidos musculares circundantes, o presente trabalho relata usando um motorista específico do coração, Hand-GAL4. Esta nova configuração genética de opsina > Hand usada para regulação cardíaca optogenética confirma ainda mais os resultados relatados anteriormente e estabelece um modelo melhor de pesquisa cardiovascular de Drosophila .
A preparação da mídia é essencial para o sucesso dos experimentos. As proteínas opsinas requerem um ligante, retinina totalmente trans (ATR), para funcionar28. As moscas não produzem ATR suficiente, então a ATR tem que ser complementada à mídia voadora. Neste estudo, o alimento instantâneo relatado anteriormente foi substituído por mídia semi-definida29. A nova receita de mídia contendo ATR foi introduzida para garantir uma distribuição uniforme de ATR. ATR não é solúvel em água; quando o estoque atr de 100 mM à base de etanol é adicionado à mídia à base de água, ele é dispersado por vórtices dos frascos que contêm mídia semi-definida quente. Além disso, a concentração de ATR relatada anteriormente foi reduzida de 10 mM para eNpHR2.0 e 3 mM para ReaChR22 para uma concentração final de 1 mM para ambos. Esta concentração é suficiente para garantir a função eNpHR2.0 adequada e ReaChR.
Um componente vital do sucesso experimental é o melhor processamento de dados com a FlyNet 2.027. O laboratório continuou a desenvolver este software para melhorar a eficiência computacional e a precisão do algoritmo automatizado de segmentação de coração de mosca. As máscaras transversais produzidas por este software são usadas para derivar dados fisiológicos de Drosophila , como encurtamento fracionado e velocidade da parede cardíaca. Essa abordagem permitiu uma análise eficiente de dados com supervisão humana mínima, tornando-a mais rápida e confiável para caracterizar a função cardíaca para grandes conjuntos de imagens cardíacas de mosca.
O infarto do miocárdio continua a ser a principal causa de morte, e a isquemia do miocárdio contribui para dois terços de todos os casos de insuficiência cardíaca, que está emergindo rapidamente entre as principais causas de mortalidade e morbidade nos Estados Unidos30. O desenvolvimento de novos dispositivos terapêuticos e médicos requer profundo conhecimento dos mecanismos de distúrbios cardíacos nos níveis fisiológico e bioquímico. Esses objetivos podem ser alcançados com a ajuda de organismos modelo. D. melanogaster estabeleceu-se como um dos modelos mais confiáveis e eficientes 31,32,33,34,35. Este trabalho gerou os modelos simulados de distúrbios cardíacos de Drosophila induzidos por uma abordagem optogenética não invasiva. O desenvolvimento de tecnologias de ritmo cardíaco óptico não invasivo fornece uma base para o desenvolvimento de uma alternativa aos dispositivos tradicionais de ritmo cardíaco elétrico. O uso do OCT para observar a função cardíaca em tempo real permite que estudos caracterizem com precisão a fisiologia cardíaca relevante em modelos de Drosophila para investigações avançadas, incluindo a triagem de candidatos a medicamentos. A imagem OCT tem uma profundidade de penetração de ~1 mm, que funciona bem para estudos cardíacos de Drosophila, mas limita seu uso para caracterizar a função cardíaca em modelos animais maiores. Além disso, traduzir diretamente a pesquisa de Drosophila para modelos de mamíferos representa um desafio. Novas ferramentas optogenéticas precisam ser desenvolvidas para melhorar a sensibilidade das opsinas e traduzi-las para vários sistemas de modelos, incluindo zebrafish, ratos, ratos e organoides cardíacos humanos, para pesquisas cardiovasculares.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a Andrey Komarov, Yuxuan Wang e Jiantao Zhu por sua ajuda na análise de dados e agradecem aos membros do laboratório Zhou por suas valiosas discussões. O trabalho no laboratório do Dr. Zhou foi apoiado por um fundo inicial da Universidade de Washington em St. Louis, o National Institutes of Health (NIH) concede R01-EB025209 e R01-HL156265, e o Clayco Foundation Innovative Research Award.
All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
Permanent double-sided tape | Scotch | ||
Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |