הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של Drosophila melanogaster המבטא eNpHR2.0 או ReaChR opsins בלב עבור הדמיית OCT וקצב לב אופטוגנטי. מדווחות הוראות מפורטות להדמיית Drosophila OCT ואפנון פעימות לב, כולל סימולציה של דום לב בר-שחזור, ברדיקרדיה וטכיקרדיה בבעלי חיים חיים בשלבי התפתחות שונים.
השימוש ב-Drosophila melanogaster (זבוב הפירות) כאורגניזם מודל הבטיח התקדמות משמעותית בתחומים רבים של מדע הביולוגיה, החל מארגון תאים וחקירות גנומיות וכלה במחקרים התנהגותיים. בשל הידע המדעי המצטבר, בשנים האחרונות הובאה דרוזופילה לתחום מידול מחלות אנושיות, כולל הפרעות לב. העבודה המוצגת מתארת את המערכת הניסיונית לניטור ומניפולציה של תפקוד הלב בהקשר של אורגניזם חי שלם באמצעות אור אדום (617 ננומטר) וללא הליכים פולשניים. שליטה על הלב הושגה באמצעות כלים אופטוגנטיים. אופטוגנטיקה משלבת את הביטוי של אופסינים מהונדסים רגישים לאור ואת ההפעלה האופטית שלהם כדי לווסת את הרקמה הביולוגית המעניינת. בעבודה זו, נעשה שימוש בהדמיית טומוגרפיה אופטית משולבת מותאמת אישית (OCT) ובמערכת גירוי אופטוגנטית כדי להמחיש ולווסת את הלב המתפקד D. melanogaster בשלבי ההתפתחות של זחל הכוכב השלישי ובשלבים ההתפתחותיים המוקדמים של הפופאל. המערכת הגנטית הכפולה של UAS/GAL4 שימשה לביטוי הלורהודופסין (eNpHR2.0) ותעלה בהזזה אדומה (ReaChR), במיוחד בלב הזבוב. פרטים על הכנת D. melanogaster להדמיית OCT חיה וקצב אופטוגנטי מסופקים. תוכנת אינטגרציה שפותחה במעבדה עיבדה את נתוני ההדמיה כדי ליצור מצגות חזותיות ומאפיינים כמותיים של תפקוד הלב של דרוזופילה . התוצאות מדגימות את ההיתכנות של ייזום דום לב וברדיקרדיה הנגרמים על ידי הפעלת eNpHR2.0 וביצוע קצב לב עם הפעלת ReaChR.
בסוף שנת 2010, כתב העת Nature Methods בחר באופטוגנטיקה כשיטת השנההראשונה. שימוש בכלים גנטיים (אופסינים מהונדסים) המווסתים על ידי אור כדי לשלוט ברקמות ביולוגיות מעניינות בדיוק ובמהירות חסרי תקדים פתח שער הצפה ליישומים חדשים. עד כה, רוב ההישגים שייכים למדעי המוח. הטכנולוגיה הוצגה כשיטה חדשה לשליטה מדויקת בנוירונים בודדים2 והתקדמה לתגליות בתחום התפקודים הקוגניטיביים של אורגניזמים חיים3. מלכתחילה, מדעני מוח הדגימו את היכולת לווסת את התנהגות האורגניזם כולו. ביטוי והפעלת אור של ChR2 opsin בעכברים נוירונים דופמינרגיים גרמו להפעלה שלהם והספיקו כדי להניע התניה התנהגותית4. עיכוב אופטוגנטי של תת-קבוצה של נוירונים המכילים הלורהודופסין NpHR2.0 שהועבר למוקד האפילפטי של מוח המכרסמים הביא להנחתה של התקפים אלקטרואנצפלוגרפיים5.
יישומים אופטוגנטיים בקרדיולוגיה מתפתחים בקצב קבוע6. ChR2 התבטא בהצלחה בתרבית תאים קרדיומיוציטים ובעכברים; קצב הלב נערך על ידי הבזקי אור כחול (שבוצעו באמצעות סיב מושתל בבעלי חיים חיים)7. בדגי זברה, ChR2 בא לידי ביטוי ושימש לזיהוי אזור הלב שעושה את הקצב; הפעלת NpHR גרמה לדום לב8. לקצב הלב האופטוגנטי יש פוטנציאל ייחודי לפיתוח טיפולי קצב וסינכרון מחדש חדשים9. לאחרונה דווח גם על ניסיונות להקים מערכת אוטוגנית להפסקת הפרעות קצב10.
מחקר מקיף ופיתוח טיפולים טיפוליים חדשים מחייבים יישום של מערכות מודל שונות, מתרבית תאים ועד יונקים. לב של בעל חוליות הוא איבר מורכב מאוד. קרדיומיוציטים (CM) מהווים שליש מכלל תאי הלב; תאים אחרים כוללים נוירונים, תאי שריר חלק וסקולריים ותאים שאינם מעוררים (כלומר, תאי אנדותל, פיברובלסטים ותאי מערכת החיסון). חקר תרבית תאי CM מגביל את תרגום התוצאות המתקבלות ליישומים רפואיים אנושיים. המניפולציות הגנטיות של אורגניזמי מודל יונקים מוגבלות וגוזלות זמן רב. למודלים קטנים יותר של חסרי חוליות יש יתרונות רבים; מערכת הלב וכלי הדם שלהם נושאת את כל האלמנטים ההיסטולוגיים החיוניים. Drosophila melanogaster (זבוב הפירות) היא מערכת מודל גנטית פשוטה ורבת עוצמה לחקור את תפקידם של גנים הקשורים למחלות אנושיות, כולל מחלות לב11,12,13. כבעלי חיים קצרי מועד, זבובי פירות מהווים הזדמנות מצוינת לדמות שינויים בתפקוד הלב התלויים בגיל או במחלות שניתן לעקוב אחריהם במהלך החיים14,15,16,17. צינור הלב של זבוב הפירות ממוקם בצד הגבי של גופו בטווח של 200 מיקרומטר מפני השטח של הקוטיקולה, מה שמאפשר לאור הנראה לעין כמעט אינפרה-אדום להגיע לצינור הלב. תכונה אנטומית זו מאפשרת קצב אופטי לא פולשני של הלב Drosophila באמצעות כלים אופטוגנטיים קיימים.
כדי לנטר את הלב Drosophila, פותחה מערכת הדמיה מותאמת אישית של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום הספקטרלי (SD-OCT) עם מודול עירור LED משולב של אור אדום18. שינויים מורפולוגיים וקצביים בלב זבוב פירות פשוט יחסית ניתנים לניתוח בקלות באמצעות טכנולוגיית הדמיה ביו-רפואית לא פולשנית זו 12,19,20,21. עם ביצועי חתך אופטי משופרים ורזולוציה מרחבית בקנה מידה מיקרוני, OCT שימש בהצלחה כדי לחקור את המבנה ולנטר את תפקוד הלב Drosophila בשלבים התפתחותיים שונים, כולל הזחל השלישי כוכב ו pupa18 מוקדם. מערכת זו מאפשרת גם ניטור וגירוי בו זמנית של מצב הלב של הדרוזופילה בבעל החיים השלם. תצוגה סכמטית של מערכת OCT מוצגת באיור 1. מערכת SD-OCT משתמשת בדיודה סופרלומינסנטית (SLD) כמקור האור (אורך גל מרכזי: 850 ננומטר ± 10 ננומטר, FWHM: 165 ננומטר, ראו טבלת חומרים). באמצעות עדשה אובייקטיבית של 10x, מערכת ההדמיה OCT יכולה להשיג רזולוציה צירית של ~4.4 מיקרומטר באוויר ו~3.3 מיקרומטר ברקמה ורזולוציה רוחבית של ~2.8 מיקרומטר, מספיק כדי לפתור פרטים עדינים של מבני לב הזבוב18,22. אותות הפרעה של אור מוחזר מזרוע הייחוס ומזרוע הדגימה מזוהים באמצעות ספקטרומטר עם מצלמת סריקת קו של 2048 פיקסלים (קצב קו מרבי: 80 קילוהרץ, ראה טבלת חומרים). רגישות המערכת הנמדדת היא ~ 95.1 dB. כל סריקת OCT במצב B יוצרת תמונת חתך במישור התמונה xz. תמונות חוזרות במצב B נרכשות באותו מיקום כדי ליצור תמונות במצב M הלוכדות את הלב הפועם במשך יותר מ- ~30 שניות 18,22,23. קצב הפריימים להדמיה במצב M הוא ~ 125 פריימים לשנייה, מספיק כדי ללכוד את הדינמיקה הפועמת של לב זבוב הפירות.
לצורך ויסות אופטוגנטי של תפקוד הלב Drosophila , מודול תאורה עם מקור אור LED 617 ננומטר משולב עם זרוע הדגימה של מערכת SD-OCT. אור הגירוי מתמקד בנקודה בקוטר ~2.2 מ”מ על משטח הדגימה, באותו מיקום כמו נקודת המיקוד של ההדמיה. תוכנה שנכתבה בהתאמה אישית משמשת לשליטה במצב התאורה (עוצמת האור, רוחב הפולס ומחזור העבודה), התאמת תדר גירוי פולס האור וסנכרון תאורת מודול ה-LED ורכישת הדמיית OCT במצב M22.
פרסומים אחרונים תיארו את המערכת המהונדסת Drosophila המורכבת מ-ChR2, ReaChR ו-eNpHR2.0 אופסינים המווסתים באופן מרחבי-טמפורלי באמצעות המערכת הגנטית UAS/GAL4. התוצאות שהתקבלו הדגימו את היכולת ליזום דום לב וברדיקרדיה הנגרמת על ידי הפעלת אור אדום של eNpHR2.0 וקצב לב בתדר גבוה יותר הנגרם על ידי הפעלת אור כחול של ChR2. ניסויי קצב דומים בוצעו עם ערוץ אחר, ReaChR, הניתן להשראה על ידי תאורת אור אדום22,23,24. ביטוי האופסין בכל הניסויים המתוארים הונע על ידי 24B-GAL4, שבו ביטוי אופסין נצפה במגוון רחב של רקמות, כולל קרדיומיוציטים ותאי שריר מסביב. במחקר הנוכחי, 24B-GAL4 הוחלף על ידי נהג Hand-GAL4 כדי להשיג ביטוי אופסינים eNpHR2.0 ו-ReaChR ספציפיים ללב.
בסך הכל, תוצאות הניסוי שהוצגו מדגימות דום לב ברדיקרדיה וטכיקרדיה הניתנים לשחזור ומחלות לב של ברדיקרדיה וטכיקרדיה. פרוטוקול מפורט עם הוראות שלב אחר שלב ליצירת מודלים של Drosophila מהונדסים וביצוע הדמיית OCT בו זמנית וניסויי קצב אופטוגנטיים בבעלי חיים מסופק.
בהשוואה לדוחות הקודמים שלנו שבהם הביטוי של אופסינים הונע לא רק בלב אלא גם ברקמות השריר שמסביב, העבודה הנוכחית מדווחת באמצעות נהג ספציפי ללב, Hand-GAL4. תצורה גנטית חדשה זו של אופסין > היד המשמשת לוויסות לב אופטוגנטי מאשרת עוד יותר את התוצאות שדווחו בעבר ומבססת מודל מחקר לב וכלי דם דרוזופילה טוב יותר.
הכנת המדיה חיונית להצלחת הניסויים. חלבוני אופסין זקוקים לליגנד, רשתית כל-טרנסית (ATR), כדי לתפקד28. זבובים אינם מייצרים מספיק ATR, ולכן יש להשלים את ATR למדיית הזבובים. במחקר זה, המזון המיידי שדווח בעבר הוחלף במדיה מוגדרת למחצה29. המתכון החדש של מדיה המכילה ATR הוצג כדי להבטיח הפצה אחידה של ATR. ATR אינו מסיס במים; כאשר מלאי ATR מבוסס אתנול של 100 mM מתווסף למדיה מבוססת מים, הוא מתפזר על ידי מערבולת הבקבוקונים המכילים מדיה חמה מוגדרת למחצה. כמו כן, ריכוז ה-ATR שדווח קודם לכן הופחת מ-10 mM עבור eNpHR2.0 ו-3 mM עבור ReaChR22 לריכוז סופי של 1 mM עבור שניהם. ריכוז זה מספיק כדי להבטיח תפקוד תקין של eNpHR2.0 ו-ReaChR.
מרכיב חיוני בהצלחת הניסוי הוא עיבוד הנתונים המשופר עם FlyNet 2.027. המעבדה המשיכה לפתח תוכנה זו כדי לשפר הן את היעילות החישובית והן את הדיוק של אלגוריתם סגמנטציה אוטומטי של לב זבוב. מסכות החתך המיוצרות על ידי תוכנה זו משמשות לגזירת נתונים פיזיולוגיים של Drosophila כגון קיצור שברים ומהירות דופן הלב. גישה זו אפשרה ניתוח נתונים יעיל עם פיקוח אנושי מינימלי, מה שהופך את זה מהיר ואמין יותר לאפיין את תפקוד הלב עבור מערכי נתונים של הדמיית לב זבוב גדול.
אוטם שריר הלב נותר הגורם המוביל למוות, ואיסכמיה שריר הלב תורמת לשני שלישים מכלל המקרים של אי ספיקת לב, אשר מתגלה במהירות בין הגורמים המובילים לתמותה ותחלואה בארצות הברית30. פיתוח טיפולים ומכשור רפואי חדשים דורש היכרות מעמיקה עם המנגנונים של הפרעות לב ברמה הפיזיולוגית והביוכימית. מטרות אלה יכולות להיות מושגות בעזרת אורגניזמים מודל. D. melanogaster ביססה את עצמה כאחד הדגמים האמינים והיעילים ביותר 31,32,33,34,35. עבודה זו יצרה את המודלים המדומים של הפרעות לב דרוזופילה המושרים על ידי גישה אופטוגנטית לא פולשנית. הפיתוח של טכנולוגיות קצב לב אופטיות לא פולשניות מספק בסיס לפיתוח חלופה למכשירי קצב לב חשמליים מסורתיים. שימוש ב-OCT כדי לבחון את תפקוד הלב בזמן אמת מאפשר למחקרים לאפיין במדויק פיזיולוגיה רלוונטית של הלב במודלים של דרוזופילה למחקרים מתקדמים, כולל סינון מועמדים לתרופות. להדמיית OCT יש עומק חדירה של ~ 1 מ”מ, מה שעובד היטב עבור מחקרי לב Drosophila אך מגביל את השימוש בו כדי לאפיין את תפקוד הלב במודלים גדולים יותר של בעלי חיים. יתר על כן, תרגום ישיר של מחקר דרוזופילה למודלים של יונקים מהווה אתגר. יש לפתח כלים אופטוגנטיים חדשים כדי לשפר את רגישות האופסינים ולתרגם אותם למערכות מודל שונות, כולל דגי זברה, עכברים, חולדות ואורגנואידים של לב האדם, לצורך מחקר קרדיווסקולרי.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לאנדריי קומרוב, יוקסואן וואנג וג’ינטאו ג’ו על עזרתם בניתוח נתונים ומודים לחברי המעבדה של ג’ואו על הדיונים החשובים שלהם. העבודה במעבדתו של ד”ר ג’ואו נתמכה על ידי קרן סטארט-אפ מאוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס, מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01-EB025209 ו-R01-HL156265, ופרס המחקר החדשני של קרן קלייקו.
All-trans retinal | Cayman Chemicals | 18449 | |
Bacto Peptone | Gibco | 02-10-2025 | |
BioLED Light Source Control Module, 4-channel | Migtex Systems | BLS-SA04-US | Part of the optogenetic stimulation module |
Broadband Light Source Module | Superlum | cBLMD-T-850-HP | Part of the SD-OCT imaging system |
Cobra-S 800 OCT Spectrometers | Wasatch Photonics | CS800-840/180-80-OC2K-U3 | Part of the SD-OCT imaging system |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professtional | 34155 | tissues |
Drosophila agar | Genesee Scientific | 66-103 | |
Drosophila culture bottles | Genesee Scientific | 32-131 | |
FlyNet 2.0 Software | Z-Lab | Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab | |
High-Power LED Collimator Sources | Migtex Systems | BLS-LCS-0617-03-22 | Part of the optogenetic stimulation module |
Inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-106 | |
Microscope slides | AmScope | BS-72P | |
Narrow plugs for Drosophila culture | Genesee Scientific | 59-200 | |
Narrow vials for Drosophila culture | Genesee Scientific | 32-116SB | |
Permanent double-sided tape | Scotch | ||
Plugs for Drosophila bottles | Genesee Scientific | 59-194 | |
Propionic Acid | Sigma | P1386-1L | |
SD-OCT control software | Z-Lab | Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab | |
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system | Z-Lab | Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM) | |
Sucrose | Carolina | 89-2871 | |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 41752 | eNpHR2.0 transgenic line |
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 53748 | ReaChR transgenic line |
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock # 48396 | Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment |
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | stock #6658 | GFP reporter line |
Yeast extract | Lab Scientific bioKEMIX | 978-907-4243 |